植物RNA提取試劑盒的操作步驟與應(yīng)用！

植物RNA提取試劑盒的操作步驟與應(yīng)用！

一、背景

植物RNA提取試劑盒用于從各種植物中提取純化高品質(zhì)總RNA，也適用于真菌菌絲RNA的提取。的Shredder分離柱，用于勻質(zhì)化和過(guò)濾高粘度的植物或真菌裂解物，同時(shí)采用硅基質(zhì)膜吸附RNA進(jìn)行純化，使多聚糖等各種污染物通過(guò)洗滌被有效去除，經(jīng)洗脫的RNA可直接用于各種下游實(shí)驗(yàn)。由本試劑盒提取RNA分子量大于200堿基，純度高，幾乎無(wú)DNA殘留。如果是對(duì)微量DNA非常敏感的RNA實(shí)驗(yàn)，殘留的DNA可利用無(wú)RNase的DNase在柱上進(jìn)行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot、RT-PCR和體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

二、操作步驟

1、50-100 mg植物組織在液氮中迅速研磨成粉末，加入600μl Buffer RL(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇)或Buffer RLC。渦旋振蕩使其充分裂解。

2、將步驟1所得全部液體轉(zhuǎn)移至已裝入收集管的過(guò)濾柱中，12000rpm(~～13400×g)離心2分鐘，將收集管中的上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管(自備)中。

3、在步驟2所得干凈的裂解液中加入0.5倍體積的無(wú)水乙醇，迅速混勻。

注意：加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，但不影響后續(xù)試驗(yàn)。

4、將上步得到的溶液轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的吸附柱中,若一次不能將全部溶液加入吸附柱中，請(qǐng)分兩次轉(zhuǎn)入;12000rpm離心15秒，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

5、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1，12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、配制DNase I混合液：取52μl RNase-Free Water，向其中加入8μl 10×Reaction Buffer和20μl DNase I(1 U/μl)，混勻，配制成終體積為80μl的反應(yīng)液。

7、向吸附柱中直接加入80μl DNase I混合液，20-30℃孵育15分鐘。

8、向吸附柱中加入350μl Buffer RW1,12000rpm離心1分鐘，棄廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入500μl Buffer RW2(使用前檢查是否加入無(wú)水乙醇),12000rpm離心15秒,棄廢液。

10、重復(fù)步驟9。

11、將吸附柱放回收集管中，12000rpm離心1分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以*晾干吸附柱中的無(wú)水乙醇。

12、將吸附柱裝入新的離心管中，向吸附膜的中間加入30-50μl RNase-Free Water，室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘，得到的RNA溶液保存在-70℃，防止降解。

三、應(yīng)用

用于馬鈴薯病毒快速檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用研究：

馬鈴薯病毒病是重要的馬鈴薯病害，每年均造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，生產(chǎn)和利用脫毒種薯是防治馬鈴薯病毒病的重要方法，快速、準(zhǔn)確的馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)是保證脫毒種薯質(zhì)量的關(guān)鍵。

研究依據(jù)馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯A病毒（PVA）、馬鈴薯S病毒（PVS）、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）基因序列設(shè)計(jì)合成了4對(duì)具毒特異性的引物。利用病毒特異性引物，以帶有不同病毒的馬鈴薯樣本總RNA為模板分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得了4條DNA片段，將4條DNA片段與克隆載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行序列測(cè)定，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析證明PCR擴(kuò)增所得DNA片段確為目標(biāo)病毒相應(yīng)的目的基因片段（核苷酸同源性達(dá)到99%以上）。

利用4對(duì)病毒特異性引物建立了4種病毒的常規(guī)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)。對(duì)馬鈴薯病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)中RNA的提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，以解決由于馬鈴薯塊莖淀粉含量過(guò)高而導(dǎo)致利用常規(guī)的植物RNA提取試劑盒無(wú)法提出塊莖RNA的問(wèn)題。首先研究開(kāi)發(fā)出一套新的馬鈴薯塊莖總RNA提取方法，利用此方法制備的RNA*符合后續(xù)進(jìn)行馬鈴薯病毒RT-PCR檢測(cè)的要求，而該方法更為快速、簡(jiǎn)便，且成本低廉，適用于大量樣品的提取檢測(cè)。

在此基礎(chǔ)上，又研制開(kāi)發(fā)了一種新型緩沖溶液，在進(jìn)行病毒檢測(cè)時(shí)，將馬鈴薯塊莖組織在此緩沖溶液中研磨勻漿后，即可直接進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，不需進(jìn)行馬鈴薯塊莖RNA的提取，因此，該方法操作更加簡(jiǎn)便，檢測(cè)效率更高，成本更低。該方法在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

對(duì)馬鈴薯病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行了改進(jìn)。利用PVS、PVY、PVA的特異性引物建立了可對(duì)3種病毒進(jìn)行同步檢測(cè)的三重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)PCR反應(yīng)中的MgCl2的濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)MgCl2濃度為5.5mmol/L時(shí)，PCR檢測(cè)。

此方法更為快速、簡(jiǎn)便、高效。采用所建立的病毒檢測(cè)技術(shù)對(duì)河南省和黑龍江省部分脫毒試管苗和脫毒種薯進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，河南省的樣本中檢出率的為PVY，其次是PVA；黑龍江省的樣本中檢出率的是PVS、其次是PLRV。采用所建立的病毒檢測(cè)技術(shù)對(duì)我國(guó)部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)中馬鈴薯病毒病發(fā)生情況進(jìn)行了調(diào)查。