瑋馳分享丨基于NK細胞的免疫治療

前言

自然殺傷（NK）細胞是起源于淋巴的細胞毒性先天免疫細胞。1973年，人們發(fā)現(xiàn)了一種非T非B淋巴細胞亞群可有效殺死被抗體識別的細胞，隨后被描述為“null”殺傷細胞。兩年后，有報道稱這種細胞能夠殺死各種類型的腫瘤細胞，并創(chuàng)造了術(shù)語“自然”殺傷細胞。NK細胞不僅在抗腫瘤反應(yīng)中發(fā)揮作用，而且在抵抗微生物感染方面也發(fā)揮作用。

NK細胞表達多種激活和抑制受體，這些受體介導的信號之間的平衡決定了NK細胞激活的結(jié)果。NK細胞在沒有預(yù)先致敏的情況下殺死癌細胞的能力在腫瘤免疫監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。以 NK 細胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個激動人心的關(guān)頭。雖然這些療法還沒有取得與過繼性 T 細胞療法同樣程度的臨床成功，但是早期的令人鼓舞的結(jié)果使 NK 細胞療法的開發(fā)熱情越來越高。

NK細胞生物學

NK細胞是個被鑒定的先天性淋巴細胞（ILC）亞型，能對病毒感染和/或轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生多種效應(yīng)器功能，主要是細胞殺傷和產(chǎn)生促炎細胞因子。NK細胞和其他ILC家族成員（—1型ILC（ILC1s）、ILC2s和ILC3s）與B細胞和T細胞來源于相同的淋巴祖細胞。NK細胞的細胞毒性活性使它們在功能上與CD8+T細胞尤為相似，而ILC1、ILC2和ILC3群體的細胞因子生成模式將這些細胞分別對應(yīng)CD4+T細胞的TH1、TH2和TH17亞群。

NK細胞的兩個典型的亞群是CD56brightCD16-和CD56dimCD16+群體。CD56bright細胞在外周血中的數(shù)量較少（循環(huán)中90%的NK細胞是CD56dim），而組織中的NK細胞主要是CD56bright。CD56bright NK細胞是強有力的細胞因子產(chǎn)生者，除非受到促炎性細胞因子如IL-15的刺激，否則細胞毒性較弱。相比之下，CD56dim NK細胞群可介導感染細胞和惡性細胞的連續(xù)殺傷，主要通過包含顆粒酶B和穿孔素的預(yù)先組裝的溶細胞顆粒在免疫突觸中的胞吐，終誘導靶細胞凋亡。

NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)機制

NK細胞具有多種功能，可以限制癌細胞的生長和擴散。在TME先天性和適應(yīng)性免疫細胞產(chǎn)生促炎性趨化因子的指導下，循環(huán)NK細胞可被招募到腫瘤發(fā)生的部位。CXCR3–CXCR4、CX3CR1和CCR3–CCR5是NK細胞亞群差異表達的主要趨化受體。

進入TME后，NK細胞可以通過“丟失自我”機制殺死癌細胞。許多癌細胞下調(diào)MHC I分子的表達，以逃避細胞毒性CD8+T細胞的檢測，然而NK細胞能夠識別和響應(yīng)這種缺失的自我表型的細胞，終導致靶細胞裂解。因此，在T細胞不能識別MHC I下調(diào)癌細胞的情況下，NK細胞具有治療潛力。

 ADCC是NK細胞介導的殺傷癌細胞的另一個關(guān)鍵機制。除了直接誘導細胞毒性外，NK細胞還通過產(chǎn)生促炎性細胞因子（包括IFN-γ和TNF）對轉(zhuǎn)化細胞作出反應(yīng)。

NK細胞的免疫檢查點抑制

關(guān)于ICI的研究主要集中在抗腫瘤T細胞的去抑制，這種治療模式增強NK細胞的活性也引起了相當大的關(guān)注。例如，人源化抗NKG2A單克隆抗體monalizumab目前正在對多種癌癥患者進行單藥試驗，或與其他免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，臨床前數(shù)據(jù)表明這種藥物能顯著增強NK細胞和T細胞的細胞毒性。

TIGIT是另一種由NK細胞和T細胞表達的抑制性受體，其配體在人類腫瘤浸潤的NK細胞上過表達。在一些小鼠模型中，TIGIT抑制逆轉(zhuǎn)NK細胞衰竭并促進NK細胞依賴性抗腫瘤免疫。已經(jīng)設(shè)計了一些積極的臨床試驗來測試單獨抗TIGIT藥物以及與其他免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用的有效性和/或安全性。（如NCT03119428、NCT04150965、NCT04047862、NCT04256421、NCT03563716和NCT04294810）

另外還有LAG-3和TIM-3，來自小鼠NK細胞研究的數(shù)據(jù)表明LAG-3在介導對腫瘤細胞系的細胞毒性方面起著積極作用；肺腺癌患者NK細胞上TIM-3表達增加預(yù)示著不良預(yù)后，體外抑制這種NK細胞的TIM-3增強了其細胞毒性和IFNγ的產(chǎn)生。目前，多個臨床試驗正在對各種癌癥患者進行LAG-3和TIM-3抑制劑的試驗，（包括NCT01968109、NCT04150965、NCT04140500、NCT03625323、NCT0331142、NCT03066648、NCT03489343、NCT03680508和NCT04139902等）。

其它基于NK細胞的免疫檢查點還包括CD96、 Siglec-7/9、CD200R、CD47、CTLA-4、PD-1和B7-H3，將這些檢查點結(jié)合起來進行協(xié)同抗腫瘤反應(yīng)是未來充分發(fā)揮NK細胞殺傷腫瘤作用的方向。

過繼性NK細胞療法

異基因外周血NK細胞只是治療性NK細胞眾多潛在來源之一。NK細胞約占外周血淋巴細胞總數(shù)的10%，而臍帶血（UCB）中的NK細胞占淋巴細胞總數(shù)的30%；因此，UCB是治療效應(yīng)NK細胞的可靠來源。UCBNK細胞的治療效果目前正在一些臨床試驗中進行評估（如NCT01619761和NCT02280525）。

克隆性NK細胞系，如NK-92、KHYG-1和YT細胞，是異基因NK細胞的替代來源，NK-92細胞系已在臨床試驗中得到廣泛測試。然而，這些細胞是非整倍體，因此遺傳不穩(wěn)定，這就要求它們在輸注前接受輻照。輻照的NK-92細胞被觀察到可以殺死癌癥患者的腫瘤細胞。

此外，臨床上正在對來自多種來源的干細胞衍生NK細胞產(chǎn)物進行檢測，包括來自UCB干細胞或誘導多能干細胞（IPSC）的NK細胞產(chǎn)物。將成年細胞重新編程為多能干細胞，以使其分化為NK細胞并擴展生成終產(chǎn)物，是基于iPSC的方法的一個特征。一項臨床試驗?zāi)壳罢谡心佳夯驅(qū)嶓w癌患者，以測試這些現(xiàn)成的iPSC衍生NK細胞的安全性。

適應(yīng)性NK細胞是治療性NK細胞的另一個新興來源。適應(yīng)性NK細胞是一種自然發(fā)生的細胞群，在HCMV感染或再激活后在人類中擴增。HCMV UL40衍生肽抗原-HLA-E復合物與NK細胞上NKG2C之間的相互作用，導致NKG2ChiCD57+NK細胞增殖，NKG2ChiCD57+NK細胞下調(diào)參與細胞內(nèi)信號傳導的某些蛋白質(zhì)，包括PLZF、SYK和FcεRIγ。適應(yīng)性NK細胞具有一些效應(yīng)器特性，包括增強的ADCC、增強的細胞因子反應(yīng)和對MDSCs和Treg細胞免疫抑制作用的固有抵抗。目前，三項臨床試驗正在評估這些適應(yīng)性NK細胞對各種癌癥患者的療效。

細胞因子誘導記憶樣（CIML）NK細胞是異基因細胞治療的另一種選擇，與其他類型的NK細胞產(chǎn)品相比具有優(yōu)勢。CIML-NK細胞在體外通過IL-12、IL-15和IL-18的短暫啟動，產(chǎn)生對細胞因子反應(yīng)增強的NK細胞，并激活持續(xù)數(shù)周至數(shù)月的受體刺激。將這些CIML-NK細胞輸注到攜帶AML異種移植物的小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生強大的抗腫瘤作用并顯著延長存活時間。在I期試驗中，CIML NK細胞具有良好的安全性，在44%的可評估AML患者（4/9）體內(nèi)擴增并誘導病情緩解。

CAR-NK

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。CAR-NK細胞免疫療法比CAR-T細胞免疫療法更安全，而且NK細胞的安全性已在一些臨床領(lǐng)域得到驗證。例如，一些I/II期試驗顯示，同種異體NK細胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細胞是一種適應(yīng)性更強的CAR載體，而不僅僅局限于自體細胞。

NK細胞上表達的功能性CAR分子由三部分組成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)的信號結(jié)構(gòu)域。胞外結(jié)構(gòu)域由一個信號肽和識別抗原的單鏈抗體片段（scFv）組成，一段鉸鏈區(qū)將這個結(jié)構(gòu)連接到跨膜區(qū)，它也在細胞內(nèi)連接到包含激活信號的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。成功的CAR設(shè)計是通過仔細的設(shè)計和功能測試相結(jié)合來實現(xiàn)的。
 

載體骨架和啟動子

載體骨架包含表達CAR所需的所有元件，如啟動子、polyA信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控片段。

啟動子的選擇直接影響到轉(zhuǎn)基因的表達水平。目前，對不同啟動子在NK細胞系中的CAR表達和功能的比較只有一次報道，而對原代NK細胞沒有比較數(shù)據(jù)。就這一次單個報告來看，還不能確定CAR-NK細胞的啟動子。

目前關(guān)于CAR-NK細胞的報道顯示，多種啟動子被用于驅(qū)動CAR的表達，無論是細胞系來源的還是原代NK細胞。在原代CAR-NK和CAR-NK細胞系中，病毒啟動子（CMV、MPSV、MMLV、SFFV等）比組成性活性啟動子（如EF1α、CMV和PGK）更常用。

信號肽

在信號肽中存在著巨大的異質(zhì)性，這直接轉(zhuǎn)化為不同水平的蛋白質(zhì)分泌效率。對于CAR-NK和CAR-T細胞，還沒有確定信號肽的比較研究。目前，CD8a-SP是原代NK細胞常用的信號肽序列（16%，71%的研究中未公布）和NK細胞系的免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽（29%）。

單鏈抗體

單鏈抗體片段是CAR的腫瘤抗原結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域?qū)Q定CAR-NK細胞的特異性和功能。

由于單鏈抗體不是抗體的天然形式，因此重鏈和輕鏈的順序是人工確定的。到目前為止，對于CAR-NK設(shè)計，大多數(shù)更喜歡VH-VL方向，而不是VL-VH方向。

Fujiwara等人證明重鏈和輕鏈的順序不影響T細胞上抗KDR CAR的表達水平。

此外，細胞可以配備多個單鏈抗體，從而擴大CAR效應(yīng)細胞的抗原識別能力。在這里，有多種選擇：CARs可以用雙元件的載體轉(zhuǎn)導，誘導兩個CAR結(jié)構(gòu)的表達；或者將兩個單鏈抗體融合在一個結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生串聯(lián)單鏈抗體的“單柄”CAR。雖然這些技術(shù)已用于生產(chǎn)CAR-T細胞，但CAR-NK細胞仍未知。

目前大多數(shù)臨床CAR-T細胞試驗都使用了來自小鼠抗體的單鏈抗體，這增加了抗小鼠IgG細胞宿主抗移植物病的風險，這個問題可以通過人源化或篩選全人抗體避免。幸運的是，在迄今為止數(shù)量有限的CAR-NK臨床試驗中，沒有發(fā)現(xiàn)與抗CAR免疫反應(yīng)相關(guān)的重大副作用。

連接區(qū)

重鏈和輕鏈之間的連接區(qū)有助于穩(wěn)定單鏈抗體的構(gòu)象，過短會導致多聚體的形成，過長可能導致水解或降低VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)。對于CAR-NK細胞，五肽GGGGS的多聚體應(yīng)用十分廣泛，通常為3個重復。另一個旨在增強蛋白水解穩(wěn)定性的連接體是Whitlow“218”連接體：GSTGSGSKPGSGEGSTKG。

目前，雖然大多數(shù)CAR-NK研究沒有提供連接細節(jié)，但已有的研究報道中，有22項使用了G4S連接，有2項應(yīng)用了218連接。

鉸鏈區(qū)

鉸鏈區(qū)是連接單鏈抗體單位和跨膜結(jié)構(gòu)域的CAR細胞外結(jié)構(gòu)區(qū)，它通常維持效應(yīng)細胞中穩(wěn)健的CAR表達和活性所需的穩(wěn)定性。大多數(shù)CAR-NK構(gòu)建使用CD8α或CD28胞外結(jié)構(gòu)域的衍生物或基于IgG的鉸鏈區(qū)。
 

鉸鏈區(qū)的類型和長度對CAR的功能活動有重要影響。但是目前大多數(shù)信息全來自CAR-T領(lǐng)域，能否直接轉(zhuǎn)化為CAR-NK還有待證明。

在CD28和CD8α鉸鏈區(qū)之間的直接比較中，發(fā)現(xiàn)CD28更有可能促進CAR分子的二聚化，因此，CD28鉸鏈區(qū)的CAR產(chǎn)生的激活刺激更強。雖然這可能是有益的，但也可能導致更嚴重的副作用。

IgG為基礎(chǔ)的鉸鏈區(qū)也廣泛應(yīng)用于CAR結(jié)構(gòu)?；贗gG鉸鏈區(qū)的一個主要優(yōu)點是結(jié)構(gòu)的靈活性，該結(jié)構(gòu)通常由IgG1或IgG4的FC部分或Fc部分的CH2/CH3結(jié)構(gòu)域組成。鉸鏈區(qū)的長度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)抗原識別，但研究發(fā)現(xiàn)，間隔區(qū)越短，細胞因子的產(chǎn)生越高，CAR-T細胞增殖越快，體內(nèi)持久性和抗腫瘤效果越好。

對于CAR-NK細胞，大多數(shù)研究在原代NK細胞（16/35）和CAR-NK細胞系（41/72）中均采用CD8α鉸鏈區(qū)。其它使用的鉸鏈區(qū)包括CD28、IgG Fc結(jié)構(gòu)域和DAP12。

跨膜結(jié)構(gòu)域

跨膜（TM）結(jié)構(gòu)域連接CAR的胞外結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)激活信號結(jié)構(gòu)域，CAR-NK常用的TM部分來自CD3ζ、CD8和CD28，但其他如NKG2D、2B4、DNAM1也有被使用。
 

TM結(jié)構(gòu)域的選擇影響了CAR結(jié)構(gòu)在細胞功能上的活化程度。通常在NK細胞上表達的分子如DNAM-1、2B4和NKG2D的TM會導致更多的CD107a脫顆粒和更高的細胞毒性，因此，TM的具體來源將決定CAR-NK的活性。

TM結(jié)構(gòu)域的一個重要方面是，TM區(qū)域應(yīng)遵循T細胞或NK細胞上跨膜蛋白的蛋白質(zhì)自然取向（N端到C端順序）。NKG2D雖然是一種強大的NK細胞激活劑，然而，天然NKG2D具有C端到N端的跨膜區(qū)。

目前，CD8α和CD28修飾的TM在原代CAR-NK細胞中常見，而CD28是CAR-NK細胞系的TM區(qū)域。

CAR-NK激活信號

CAR的細胞內(nèi)激活信號的數(shù)量決定了其屬于哪一“代”CAR。

代CAR-NK細胞與CAR-T細胞一樣，只含有CD3ζ信號。第二代和第三代CAR-NK分別攜帶一個和兩個額外的共刺激信號，共刺激分子通常來源于CD28家族（CD28和ICOS）、TNFR家族（4-1BB、OX40和CD27）或SLAM相關(guān)受體家族（2B4）。到目前為止，公布的CAR-NK臨床試驗采用了第二代CAR-NK構(gòu)建，該構(gòu)建通過加入IL-15表達和誘導Caspase9增強活性。

目前大多數(shù)CAR結(jié)構(gòu)依賴于CD3ζ鏈信號域，強烈的激活信號對于誘導有效的抗腫瘤反應(yīng)很重要，但也可能導致效應(yīng)細胞的快速衰竭。因此，共刺激域的組合可用于校準所需的免疫細胞反應(yīng)。與基于4-1BB的 CARs相比，基于CD28的CARs表現(xiàn)出更快的效應(yīng)器特征，誘導更高水平的IFN-γ、顆粒酶B、TNF-α。然而，這種強烈的共刺激信號也會導致活化誘導的細胞死亡（AICD）。

相比較，4-1BB-CD3ζ信號優(yōu)先誘導記憶相關(guān)基因和持續(xù)的抗腫瘤活性。原因可能是4-1BB結(jié)構(gòu)域改善了CD28結(jié)構(gòu)域引起的T細胞耗竭。
 

如上圖所示，在CAR-NK細胞系和原代CAR-NK細胞的研究中，CD3ζ幾乎被普遍用作主要的激活域，其中大約一半攜帶一個額外的激活域，通常添加4-1BB或CD28。至于第三代結(jié)構(gòu)，CD28/4-1BB/CD3ζ的組合是常用的。

NK細胞定向接合器

各種免疫逃避機制限制了NK細胞在體內(nèi)與腫瘤細胞的結(jié)合程度，是實現(xiàn)廣泛有效的NK細胞治療的主要障礙。為了增強腫瘤浸潤性NK細胞的自然細胞毒性，許多研究團隊已經(jīng)在開發(fā)一些分子，使這些細胞以抗原特異性的方式與腫瘤細胞接觸。這些分子通常是由多個抗體（通常為單鏈抗體）組成的雙特異或三特異性接合器，使得一個結(jié)構(gòu)域針對NK細胞激活受體，另一個與特定腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。例如，一種由兩個單鏈抗體組成的三特異性殺傷接合器（TriKE），一個針對NK細胞上的CD16，另一個針對AML細胞的CD33，通過IL-15結(jié)構(gòu)域連接，該結(jié)構(gòu)域旨在增強NK細胞的存活和增殖。

這種抗CD16、IL-15和抗CD33 TriKE（GTB-3550）增強了NK細胞效應(yīng)器功能的其他幾個重要方面，在臨床前研究中觀察到了改善遷移能力、增加連續(xù)殺傷和縮短殺傷時間。

在臨床前研究中，其他幾種NKCE分子也被證明具有強大的抗腫瘤作用。AFM13靶向淋巴瘤相關(guān)抗原CD30和CD16a，后者是NK細胞表達的CD16的跨膜形式。AFM13在AACR 2022中表現(xiàn)驚艷，AFM13+臍血來源NK細胞治療，緩解率達到62%。

展望

自然殺傷細胞是一組抗腫瘤效應(yīng)細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產(chǎn)生細胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。一些癌癥的發(fā)生與功能失調(diào)的NK細胞有關(guān)。因此，修復這種NK細胞可能是抗腫瘤免疫治療的一個潛在選擇。這種修復的一種方法是抑制免疫檢查點，即癌細胞通過控制免疫細胞表面的抑制受體進行免疫逃逸。

利用NK細胞與抗體、免疫細胞接合器、CARs和其它檢查點抑制劑的組合方法進行試驗，這些方法旨在調(diào)節(jié)抑制檢查點和增強抗腫瘤能力。目標是找到一種基于NK細胞的治療策略，這種策略是安全的，并且具有廣泛臨床應(yīng)用所需的確切療效。

來源：生物藥學科普

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