共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)|周細(xì)胞與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)遷移試驗(yàn)

　　應(yīng)用Ibidi傷口愈合插件進(jìn)行共培養(yǎng)“傷口愈合”實(shí)驗(yàn)，對(duì)周細(xì)胞與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞做共培養(yǎng)遷移試驗(yàn)。

　　實(shí)驗(yàn)步驟:

　　1）鋪細(xì)胞（圖二）　　

　　將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。在ibidi細(xì)胞插件的每孔中分別加入1.5 ×104的PMVECs和Pericyte的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。在37℃培養(yǎng)箱中孵育　　

　　圖二，ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞

　　2）形成“劃痕”　　

　　采用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞16小時(shí)。如圖四所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除?！　?/p>

　　圖三，移除插件

　　移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。　　

　　小心的清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)（圖四）　　

　　采集并分析圖像：　　

　　在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向最好是水平或者垂直?！　?/p>

　　采集0h和6h的圖像，觀測(cè)細(xì)胞的遷移率和細(xì)胞遷移方向，用中性粒周蛋白定位微管生長(zhǎng)中心（MTOC）并用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-actin　　

　　由圖可見，相對(duì)于左側(cè)的對(duì)照，右邊的PAH來源的Pericytes遷移距離較短，并且從熒光標(biāo)記圖上可見，紅色箭頭表示遷移的方向，PAH組無特定方向，不受PMVEC的影響。柱狀圖為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。