共培養(yǎng)遷移實(shí)驗(yàn)|周細(xì)胞與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)遷移試驗(yàn)
應(yīng)用Ibidi傷口愈合插件進(jìn)行共培養(yǎng)“傷口愈合”實(shí)驗(yàn),對(duì)周細(xì)胞與肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞做共培養(yǎng)遷移試驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)步驟:
1)鋪細(xì)胞(圖二)
將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。在ibidi細(xì)胞插件的每孔中分別加入1.5 ×104的PMVECs和Pericyte的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。在37℃培養(yǎng)箱中孵育
圖二,ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞
2)形成“劃痕”
采用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞16小時(shí)。如圖四所示,小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角,將插件移除?! ?/p>
圖三,移除插件
移除插件后,要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”。
小心的清洗細(xì)胞,之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)(圖四)
采集并分析圖像:
在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像,“劃痕”的方向最好是水平或者垂直。
采集0h和6h的圖像,觀測(cè)細(xì)胞的遷移率和細(xì)胞遷移方向,用中性粒周蛋白定位微管生長(zhǎng)中心(MTOC)并用鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-actin
由圖可見(jiàn),相對(duì)于左側(cè)的對(duì)照,右邊的PAH來(lái)源的Pericytes遷移距離較短,并且從熒光標(biāo)記圖上可見(jiàn),紅色箭頭表示遷移的方向,PAH組無(wú)特定方向,不受PMVEC的影響。柱狀圖為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
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