超高純度純化單克隆抗體——使用疏水層析填料純化

在抗體藥物生產(chǎn)的下游工藝中，一般會(huì)在捕獲階段（Protein A親和層析）之后的精制步驟中，采用兩種不同分離模式的層析法進(jìn)行純化。疏水層析（HIC）是能有效去除多聚體等雜質(zhì)的分離模式。

I. R. A. P. Bresolin, N. Lingg, I. T. L. Bresolin and A. Jungbauer

Hydrophobic interaction chromatography as polishing step enables obtaining ultra-pure recombinant antibodies

J. Biotechnology: X6 (2020) 100020

（要點(diǎn)）

·在精制步驟中使用HIC填料TOYOPEARL Phenyl-650M，分離純化出了超高純度的抗腫瘤壞死因子抗體（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）。

·對(duì)HIC模式下的吸附等溫線、穿透曲線、層析分離等實(shí)施了評(píng)估。

·通過(guò)HIC純化的抗體的純度是99.9%，回收率是96.2%。并且確認(rèn)到，抗體組分中混入的多聚體雜質(zhì)、宿主細(xì)胞蛋白（HCP）、DNA都在檢驗(yàn)要求范圍之內(nèi)。

·在需要制備超高純度的抗體時(shí)，可在下游純化工藝中使用該HIC分離法。

● 抗腫瘤壞死因子抗體（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）的純化

樣品：抗腫瘤壞死因子抗體（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）

參照抗體：阿達(dá)木單抗 (Adalimumab，商品名：Humira^® )

動(dòng)態(tài)吸附載量（TOYOPEARL Phenyl-650M）：12.05 g/L

色譜柱尺寸：5 mm I.D. × 2.55 cm、駐留時(shí)間：2.5 min（流速：0.2 mL/min）

洗脫溶液：20 mmol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.4）＋ 1 mol/L 硫酸銨

多聚體的分析、定量：TSKgel^® G3000SWXL

● 使用疏水填料TOYOPEARL Phenyl-650M對(duì)抗體進(jìn)行超高純度純化

（分離出的抗體洗脫峰1和洗脫峰2的純度測(cè)定，請(qǐng)繼續(xù)閱讀下一頁(yè)）

●
對(duì)疏水層析（HIC）純化后的抗體（Peak 1）進(jìn)行純度測(cè)定

^a by UV at 280 nm, ^b by SEC at 280 nm, ^c by SEC at 215 nm, ^d ELISA, ^e PCR resDNASEQ^®

* Below lower limit of detection (LLOD), undiluted sample used

** Data from LC/MS/MS by Oliviero et al., Easy, Fast and Reproducible Analysis of Host Cell Protein (HCP) in Monoclonal Antibody Preparations, Application Note (2019)

Ref.: I. R. A. P. Bresolin et al., J. Biotechnology: X6 (2020) 100020

※通過(guò)HIC，獲得了比市售抗體藥物阿達(dá)木單抗更高純度的抗體組分。

● 抗體純化時(shí)HIC填料選擇的要點(diǎn)

·根據(jù)抗體的疏水性，選擇疏水性適度的HIC填料（官能團(tuán)、細(xì)孔徑、粒徑等參數(shù)的不同），優(yōu)化抗體的回收率和分離選擇性（去除雜質(zhì)）

·優(yōu)化分離時(shí)的洗脫條件（緩沖液濃度、pH、鹽濃度、流速、梯度的傾斜度、溫度等）

·設(shè)置穩(wěn)定的線性梯度洗脫條件，使抗體在梯度的中間部分洗脫出來(lái)

·HIC填料的疏水性：（低） Ether-650/PPG-600 < Phenyl-650/600 < Butyl-650/600 < Hexyl-650 （高）

● HIC填料和篩選用預(yù)裝柱產(chǎn)品一覽表