瑋馳分享丨快速了解“單細(xì)胞技術(shù)”與“傳統(tǒng)流式技術(shù)”檢測(cè)胞內(nèi)蛋白的區(qū)別

IsoPlexis的單細(xì)胞蛋白組技術(shù)不僅可以“向外看”---檢測(cè)培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞胞外分泌的細(xì)胞因子；也可以“向內(nèi)看”---檢測(cè)單細(xì)胞水平胞內(nèi)蛋白。使用細(xì)胞內(nèi)蛋白組學(xué)相關(guān)panel可以在幾天內(nèi)揭示腫瘤靶向治療中信號(hào)通路變化。

在腫瘤治療耐藥性研究中，研究人員經(jīng)常通過(guò)基因組研究來(lái)了解腫瘤的微環(huán)境和信號(hào)通路，但腫瘤中一些功能的適應(yīng)性變化沒(méi)有引起基因?qū)用娴母淖?，所以僅憑基因組學(xué)研究很難提供腫瘤治療耐藥性機(jī)制的完整信息。單細(xì)胞胞內(nèi)蛋白組解決方案是研究腫瘤信號(hào)通路和治療耐藥性基礎(chǔ)的關(guān)鍵工具，幫助研究人員進(jìn)行完整的功能表征。

檢測(cè)胞內(nèi)蛋白的區(qū)別

傳統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白方法之一是流式細(xì)胞術(shù)，進(jìn)行表面抗體標(biāo)記分型細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞固定破膜，讓熒光抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記胞內(nèi)磷酸化蛋白。這聽(tīng)起來(lái)不難，但實(shí)際有好幾個(gè)需要考慮的實(shí)驗(yàn)步驟。

首先，固定破膜液的選擇會(huì)影響抗體標(biāo)記的效果，還要兼顧表面標(biāo)記不受胞內(nèi)熒光抗體的影響。其次是抗體的挑選跟配色方案，不是所有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的抗體都可以不受固定破膜液的影響，標(biāo)記到胞內(nèi)磷酸化蛋白；抗體上帶的熒光染料也有可能被固定液破壞導(dǎo)致信號(hào)不足。如果一次想看好幾個(gè)胞內(nèi)磷酸化蛋白，還要考慮抗體之間的特異性不跟其它蛋白交叉反應(yīng)，以及熒光染料之間的熒光補(bǔ)償問(wèn)題。倘若還要考慮表面蛋白標(biāo)記分型的抗體，整個(gè)流式抗體配色方案就要思考設(shè)計(jì)一整天，更不用說(shuō)實(shí)驗(yàn)后還得根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果優(yōu)化整個(gè)方案了，幾次實(shí)驗(yàn)下來(lái)花費(fèi)的時(shí)間可能就是幾周了。總結(jié)以上幾點(diǎn)，一般流式檢測(cè)胞內(nèi)磷酸化蛋白靶標(biāo)只能是2-5種。

IsoPlexis單細(xì)胞胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組解決方案針對(duì)每個(gè)芯片中500-1500個(gè)單個(gè)細(xì)胞，分析每個(gè)細(xì)胞多達(dá)15種磷酸化蛋白。經(jīng)過(guò)反復(fù)驗(yàn)證的抗體組合，通過(guò)這些信號(hào)通路中關(guān)鍵磷酸化蛋白的表征研究細(xì)胞信號(hào)通路，研究整個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的變化，并揭示關(guān)鍵的適應(yīng)性耐藥途徑。IsoPlexis系統(tǒng)還是全自動(dòng)化運(yùn)行的，單細(xì)胞懸液樣本加入微流控芯片后，細(xì)胞在芯片中進(jìn)入單細(xì)胞微室、裂解單細(xì)胞，微室為磷酸化蛋白檢測(cè)提供了一個(gè)更大的捕獲區(qū)域（圖1），單細(xì)胞的分離、裂解，以及細(xì)胞內(nèi)蛋白的檢測(cè)都由儀器自行完成。
 

圖1：以流式為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)方法與單細(xì)胞胞內(nèi)蛋白組技術(shù)對(duì)比
 

需要特別指出的是流式配色panel設(shè)計(jì)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。使用IsoPlexis單細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)避免了復(fù)雜流式配色panel的設(shè)計(jì)，系統(tǒng)使用條形碼抗體，避免了檢測(cè)過(guò)程中不同蛋白之間的相互干擾。IsoPlexis進(jìn)行了相關(guān)的方法開(kāi)發(fā)，配套的芯片panel已被驗(yàn)證和優(yōu)化，適用于不同的應(yīng)用方向（圖2），不需要研究人員進(jìn)行優(yōu)化，可立即使用 。這意味著研究人員不需要耗費(fèi)可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)個(gè)月的時(shí)間去建立方法，開(kāi)發(fā)panel，再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；只需要幾天內(nèi)就可以得到結(jié)果。

圖2：經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的panel

應(yīng)用案例之一：在腫瘤靶向治療的過(guò)程中，一旦對(duì)治療產(chǎn)生耐藥性，腫瘤就會(huì)復(fù)發(fā)，必須開(kāi)發(fā)更好的治療方案。治療耐藥性的表征對(duì)于創(chuàng)建有效治療方案至關(guān)重要；因?yàn)槟[瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性，定義和測(cè)量每個(gè)腫瘤細(xì)胞對(duì)信號(hào)通路的貢獻(xiàn)至關(guān)重要。通過(guò)同時(shí)對(duì)不同信號(hào)通路中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的多達(dá)15個(gè)磷酸化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，可以幫助分析多重蛋白之間關(guān)聯(lián)性，評(píng)估信號(hào)通路是否被抑制，或者新的信號(hào)通路是否建立，進(jìn)一步得到完整的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)信息，評(píng)估治療方案的耐藥性，以確定有效的靶點(diǎn)（圖3）。

另一篇應(yīng)用在Cancer Cell的一篇文章中：利用IsoPlexis的單細(xì)胞胞內(nèi)蛋白組技術(shù)，研究人員能夠通過(guò)分析信號(hào)通路中不同磷酸化蛋白的協(xié)同關(guān)系評(píng)估膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療耐藥性的產(chǎn)生。研究表明，耐藥性可以通過(guò)一種非遺傳（適應(yīng)性）機(jī)制進(jìn)行，該機(jī)制在單一抑制劑用藥后的幾天內(nèi)被激活（圖3）。
 

圖3：用藥后，胞內(nèi)信號(hào)通路的改變

單一藥物治療后，測(cè)量到腫瘤胞內(nèi)功能的適應(yīng)性變化提示研究者進(jìn)行聯(lián)合治療，即同時(shí)使用多種靶向藥物進(jìn)行治療，應(yīng)對(duì)單一藥物治療帶來(lái)的耐藥性問(wèn)題。結(jié)果顯示多藥聯(lián)用可以有效阻止腫瘤生長(zhǎng)（圖4）。這種單細(xì)胞分析方法為設(shè)計(jì)更有效的腫瘤聯(lián)合治療策略提供了可能。
 

圖4：多種藥物聯(lián)用，評(píng)估有效治療方案

IsoPlexis單細(xì)胞蛋白質(zhì)組檢測(cè)技術(shù)相比傳統(tǒng)方法省去了流式實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，全自動(dòng)儀器節(jié)省了實(shí)驗(yàn)人力物力，更重要的是節(jié)省寶貴的樣本，使用單細(xì)胞胞內(nèi)磷酸化蛋白質(zhì)組芯片針對(duì)15種磷酸化蛋白捕獲相對(duì)完整的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)信息。另外還有單細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組及多重細(xì)胞因子蛋白質(zhì)組芯片，3款芯片聯(lián)用可以更地了解免疫細(xì)胞對(duì)不同治療方案的功能性反應(yīng)。
 

文章來(lái)源：IsoPlexis