脯氨酸（PRO測(cè)定試劑盒分光光度法說(shuō)明書(shū)

                                     分光光度法50管/48樣

注   意 ：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

Pro廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，逆境條件下，植物體內(nèi)Pro含量顯著增加。Pro增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性強(qiáng)的品種往往積累較多的脯氨酸。因此，脯氨酸增加量可以作為抗逆育種的生理指標(biāo)之一。 

測(cè)定原理：

用磺基水楊酸（SA）提取Pro，加熱處理后，Pro與酸性茚三酮溶液反應(yīng)生成紅色；加甲苯萃取后，在520nm測(cè)定吸光度。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、冰乙酸50mL、甲苯50mL、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：冰乙酸25 mL×1瓶， 4℃保存。（自備）

試劑二：液體25 mL×1瓶， 4℃保存。

試劑三：甲苯50mL×1瓶，4℃保存。（自備）

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樣品測(cè)定的準(zhǔn)備： 

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；之后置95℃水浴振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻后待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行勻漿；之后置95℃水浴振蕩提取10min；10000g，25℃離心10min，取上清，冷卻后待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：按照血清（漿）體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清（漿）加入1mL提取液），充分混勻，之后置95℃水浴振蕩提取10分鐘，10000g，25℃離心10分鐘，取上清，冷卻后待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至520nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 樣本測(cè)定：

(1)取0.5mL樣本+0.5mL試劑一+0.5mL試劑二 于有蓋試管中，置95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），每10min振蕩一次。

(2)待冷卻后，在試管中加入1mL試劑三，振蕩30s，靜置片刻，使色素轉(zhuǎn)至試劑三中；吸取0.8mL-1mL上

層溶液于1mL玻璃比色皿中，于520nm波長(zhǎng)處比色，記錄吸光值A。

Pro含量計(jì)算：

1、典型回歸方程y = 0.0521x - 0.0021  (x為脯氨酸含量，μg/mL；y為吸光值A)

2、按照血清（漿）體積計(jì)算

Pro含量(μg/mL)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

Pro含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

Pro含量(µg/g鮮重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

Pro含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.5mL；V2：加入提取液體積，1 mL；V3：加入血清（漿）體積，0.1 mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

注意：檢測(cè)限為1μg/mL或1μg /g鮮重 或0.01μg /mg prot

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