CRISPR-Cas9?核酸復(fù)合物SEC分離的優(yōu)秀選擇

（引用文獻(xiàn)）

J. Camperi et al., Physicochemical and Functional Characterization of Differential CRISPR-Cas9 Ribonucleoprotein Complexes, Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND

（要點(diǎn)）

這是一項(xiàng)革新性的生物技術(shù)：與DNA的重復(fù)序列CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）相關(guān)的基因組DNA切割酶（CRISPR-associated protein; Cas）和單分子向?qū)NA（sgRNA）形成復(fù)合物（RNP），識(shí)別DNA上特定的堿基序列，進(jìn)行精準(zhǔn)剪切甚至修復(fù)。這項(xiàng)技術(shù)在基因治療藥物、農(nóng)作物的基因改變以及診斷試劑等多個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用開(kāi)發(fā)正在不斷推進(jìn)中。

文獻(xiàn)作者等研究人員利用超高性能尺寸排阻色譜（UP-SEC）和多種檢測(cè)器分析CRISPR/Cas9、sgRNA及其復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)各成分中存在多聚體。另外，還使用陰離子交換色譜（AEC/AEX）分析切割的DNA片段，對(duì)CRISPR/Cas9中的酶活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多聚體會(huì)影響復(fù)合物的形成，降低酶活性。由此可知色譜分析對(duì)CRISPR-Cas、sgRNA等的基因編輯所用試劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)有效。

● CRISPR-Cas9、sgRNA及其復(fù)合物的SEC分離

使用TSKgel UP-SW3000對(duì)CRISPR/Cas9、sgRNA及其復(fù)合物進(jìn)行了UP-SEC分析。在各成分及其復(fù)合物（分子量約180 kDa）中發(fā)現(xiàn)了多聚體，特別是在sgRNA（約100堿基）中發(fā)現(xiàn)存在大量二聚體、三聚體和四聚體（參閱下一頁(yè)數(shù)據(jù)）?？梢钥闯鲞@些多聚體對(duì)CRISPR/Cas9的復(fù)合物形成以及DNA剪切活性有影響。

Ref.: J. Camperi et al., Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND

● sgRNA的多聚體分析及CRISPR/Cas9的DNA剪切活性

在分析sgRNA的多聚體時(shí)，串聯(lián)2支TSKgel UP-SW3000，通過(guò)UP-SEC進(jìn)行更細(xì)致的分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)sgRNA進(jìn)行70℃的熱處理時(shí)多聚體會(huì)消失，幾乎變?yōu)閱误w，在CRISPR/Cas9的復(fù)合物中，多聚體也會(huì)減少。另外，在使用AEC/AEX分析DNA片段時(shí)還發(fā)現(xiàn)，如果使用熱處理后的sgRNA，CRISPR/Cas9的DNA剪切活性也會(huì)提高。

Ref.: J. Camperi et al., Anal. Chem. 2022, 94, 2, 1432–1440, CC BY NC ND

● 總結(jié)、考察

使用UP-SEC色譜柱，可對(duì)CRISPR/Cas9和sgRNA的多聚體等物理特性進(jìn)行高分辨率分析。另外還發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)使用AEC/AEX分析DNA片段，來(lái)評(píng)價(jià)CRISPR/Cas9的DNA剪切活性。由此可知，在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用中，對(duì)基因編輯試劑CRISPR/Cas9和sgRNA的質(zhì)量管理、酶活性的評(píng)價(jià)中，UP-SEC和AEC/AEX是非常有效的分析手段。

* 蛋白質(zhì)、肽、核酸等SEC分析的相關(guān)技術(shù)資料，可聯(lián)系我司或代理店銷售人員索取。