神經(jīng)精神病學研究中的重大挑戰(zhàn)之一便是開發(fā)能準確反映與情感障礙相關的癥狀的動物模型。慢性社交挫敗應激模型已被證明是研究抑郁癥的有效模型。在該模型中，C57BL/6J小鼠連續(xù)10天遭受CD-1小鼠攻擊，誘導其產(chǎn)生慢性社交挫敗應激。本文描述了CD-1攻擊小鼠的篩選過程，C57BL/6J和CD-1攻擊小鼠之間的社交互動，以及作為抑郁樣行為指標的社會回避評分的分析。

關鍵詞：社交挫敗，抑郁，慢性應激，社會互動，小鼠模型

 研究背景

抑郁癥是一種反復發(fā)作且危及生命的疾病，影響著全球約1.2億人。在神經(jīng)精神病學研究領域中，開發(fā)有效的抑郁癥動物模型至關重要，有效的動物模型可幫助人類理解抑郁癥背后的神經(jīng)和分子機制。目前，用于誘發(fā)小鼠的抑郁癥的各種慢性應激包括：慢性不可預測應激，足部電刺激應激，束縛應激等，隨后可測量其快感缺失或絕望行為（如蔗糖偏愛測試，強迫游泳測試和懸尾測試），但這些慢性應激誘發(fā)的抑郁效果都不夠理想。與此同時，慢性社交挫敗應激由于其可靠性和可重復性，已被廣泛接受為抑郁癥的有效模型。社交挫敗范式已被證實為一種很好的抑郁模型，原因如下：1)易感小鼠的抑郁表型（社交回避、快感缺失、代謝變化等）可通過慢性抗抑郁藥物的治療而逆轉(zhuǎn)，但急性給藥對其沒有效果。2)社交挫敗應激產(chǎn)生易感表型和抗性表型可以用來解釋抑郁癥病理生理學中人類應激易感性的個體差異。3)由社交挫敗應激引起的易感表型是長期存在的，并伴隨著大腦獎賞回路的遺傳和表觀遺傳變化。

 材料和試劑

1、C57BL/6J小鼠（購自Jeckson實驗室）：使用7-8周齡小鼠進行社交挫敗造模（6-7周齡小鼠需要進行一周的環(huán)境適應期）

注：小鼠置于標準籠里，每個籠子限4-5只小鼠。

2、CD-1小鼠（(Charles River實驗室）：將4-6個月大的雄性非繁殖鼠單獨飼養(yǎng)于標準鼠籠內(nèi)。

注：社交挫敗范式使用受試小鼠的統(tǒng)一從屬關系作為社交應激源，在本方案中采用了最常見的C57BL/6J：CD-1從屬關系。

清潔試劑（用于清潔場地和作為社交互動場地/分隔器的樹脂玻璃）：0.5%過氧化氫。

設備

1.透明鼠籠（帶墊料的一次性鼠籠）（Innovive，目錄編號：RS1-H-C8)

2.標準水瓶（小鼠水瓶）（Innovive，目錄編號：M-WB-300)

3.帶吸管的水瓶塞（氯丁橡膠塞）（Ancare，目錄編號：OT-199-3”）

4.圓筒支架（定制的塑料支架，可作為額外的水口；圖2B)

5.分隔器（定制的透明穿孔樹脂玻璃板；圖2B)

6.可拆卸外殼（定制的透明有機玻璃，頂部和底部均打開；圖3B)

7.秒表

8.露天試驗室（定制，44（寬）x 44（長） x 30（高）；厘米）

9.社交互動測試視頻跟蹤系統(tǒng)（如VisuTrack動物行為分析軟件，CCD攝像機及計算機）

實驗流程

1、CD-1攻擊性小鼠的篩選 

a.訂購4-6個月大的雄性CD-1小鼠（至少多訂購2-3倍，因為只有不到一半的CD-1小鼠具有足夠的攻擊性）。CD-1小鼠單獨安置在標準鼠籠里，給予足夠的食物和水。并使CD-1小鼠在開始篩選過程前適應它們的新環(huán)境一周。

b.僅用于篩選CD-1小鼠的C57BL/6J雄性“篩選鼠”?！昂Y選鼠”的年齡范圍在8-20周，并可用于后續(xù)的篩選過程。在此過程中需要排除具有攻擊性的“篩選鼠”。

c.CD-1小鼠的篩選是在CD-1小鼠的籠子中進行的。C57BL/6J“篩選鼠”直接放入CD-1小鼠籠中5 min。記錄每只CD-1小鼠的攻擊潛伏期，連續(xù)3天，每天一次，進行三次篩選。

d.CD-1攻擊小鼠的篩選標準：在三次篩選過程中，CD-1攻擊小鼠連續(xù)兩個階段初始攻擊潛伏期必須小于60秒，且必須連續(xù)攻擊C57BL/6J “篩選鼠”至少10秒。

e.CD-1攻擊小鼠在初始篩選后可使用3個月（CD-1攻擊性小鼠可能習慣社交挫敗過程，因此需要在下一次社交挫敗實驗之前重新篩選）。

2、慢性社交挫敗應激（圖1）

圖1|社交挫敗應激造模和社交互動測試的示意圖（慢性社交挫敗造模方案使用CD-1攻擊性小鼠執(zhí)行了連續(xù)10天的社交挫敗，然后進行社交互動測試和后續(xù)分析）

a.組裝社交挫敗籠（圖2A)，取標準鼠籠，籠底部填充木片墊料。將穿孔的有機玻璃分隔板放置在籠子的中心。社交挫敗鼠被隔離出來，并允許其在非社交挫敗區(qū)域內(nèi)進行感官互動。放置圓柱體（附加的水瓶架）在標準水瓶的對面。用圓筒支架插入組裝好的水瓶。確保鼠能飲用到水。將食物放在兩側(cè)的底部（水和食物應隨意供應）。將標準鼠籠蓋牢固地放在鼠籠上。為期10天的社交挫敗方案至少需要10個帶有CD-1攻擊鼠的社交挫敗籠。

注意：分隔器應裝配牢固，防止小鼠逃逸。

圖2|慢性社交挫敗應激的標準籠（A.用于慢性社交挫敗應激造模的標準鼠籠：CD-1攻擊小鼠被永-久安置在穿孔分隔器的一側(cè)，而C57BL/6J小鼠每天在兩側(cè)交換位置，以防止對攻擊的習慣化。B. 標準鼠籠的附加部件尺寸（定制）：在標準水瓶側(cè)的對面的圓筒支架裝有一個額外的水瓶。在非社交挫敗環(huán)節(jié)期間，穿孔的有機玻璃分隔器隔離兩種老鼠（允許感官互動））。

b.在社交挫敗環(huán)節(jié)開始前一晚，將CD-1攻擊鼠放置在已被分隔的鼠籠的一側(cè)，使其適應新環(huán)境。

注：首-選圓筒支架側(cè)。

c.在社交挫敗環(huán)節(jié)的第一天，將C57BL/6J小鼠直接放入CD-1攻擊小鼠同一側(cè)。在5-10 min的社交挫敗后（視頻源如下），將C57BL/6J鼠轉(zhuǎn)移到穿孔隔板的對側(cè)，持續(xù)24小時。

注意：在社交挫敗環(huán)節(jié)開始時，將C57BL/6J鼠放在靠近CD-1攻擊鼠附近有助于啟動其攻擊性行為。可同時對10只受試小鼠進行社交挫敗應激。

d.對照組應將C57BL/6J小鼠放置在一個相同的社交挫敗籠中，在穿孔有機玻璃分隔器的兩側(cè)各設置一只小鼠（將CD-1小鼠替換為C57BL/6J小鼠），持續(xù)10天，禁止任何身體接觸。這些小鼠同樣在隔板兩側(cè)轉(zhuǎn)換。

e.每只受試的C57BL/6J小鼠將每天面臨1只不同的CD-1小鼠，連續(xù)重復上述社交挫敗操作10天。

f.在最后一次社交挫敗之后，單獨飼養(yǎng)所有C57BL/6J小鼠。所有的CD-1攻擊性小鼠也都送回它們單獨飼養(yǎng)的籠子里，用于未來的社交挫敗實驗（未來需要根據(jù)其攻擊性重新篩選）。

3、社交互動測試

a.社交互動測試在最后一次社交挫敗后24小時進行。在社交互動測試中，CD-1攻擊小鼠對于被測試的C57BL/6J小鼠應該是完-全陌生的。在進行社交互動測試前，篩選CD-1攻擊性小鼠，以確保小鼠符合攻擊性標準。

b.社交互動場地如圖3所示。配置視頻跟蹤系統(tǒng)（如VisuTrack軟件），通過跟蹤軟件自動收集所有數(shù)據(jù)。

圖3|社交互動測試場地的示意圖（A.社會互動分析的區(qū)域劃分。B. 可拆卸的穿孔有機玻璃外殼，外殼內(nèi)部放入CD-1小鼠）

c.在與外部噪聲源和動物隔離及紅光條件下，于社交互動測試前先讓受試鼠適應環(huán)境1小時。

d.在紅光條件下，每個社交互動測試都由兩個2.5 min的階段組成。在第一階段，將社交挫敗模型小鼠放入社交互動區(qū)域（在有機玻璃外殼對面的中心），并允許其在沒有CD-1小鼠的情況下自由探索。

注意：在第一階段比賽結束后，不要清理實驗場地。

e.在第一階段結束后，將模型鼠取回，直到第二階段。然后，將CD-1鼠標直接放入有機玻璃外殼內(nèi)。

注意：將CD-1鼠從外殼頂部輕輕放下。

f.在第二階段，重新放入模型鼠，并讓它在CD-1小鼠存在的情況下自由移動。

注意：在兩個階段之間以相同的方式放置模型鼠。

g.在每次測試結束時。使用清潔液清洗所有設備。

h.數(shù)據(jù)可以按照數(shù)據(jù)分析部分中的描述進行分析。

 數(shù)據(jù)分析 

使用自動視頻跟蹤系統(tǒng)，可以從每個試驗的視頻數(shù)據(jù)中計算出交互區(qū)和角落區(qū)的停留時間。在本研究中，對照組小鼠通常在互動區(qū)花費的時間更多，而模型鼠的社交互動時間顯著減少（圖4）。因此，小鼠的社交能力可以通過比較在CD-1鼠的互動區(qū)域內(nèi)的停留時間來量化。社交互動比（SI ratio）計算方法如下：

注：Interaction zone time of "target" trial——CD-1攻擊鼠存在情況下，受試鼠在互動區(qū)域內(nèi)停留時間；

Interaction zone time of "no target" trial——CD-1攻擊鼠不存在的情況下，受試鼠在互動區(qū)域內(nèi)停留時間。

SI比值低于100%的小鼠被歸為抑郁易感小鼠，另一方面，SI比值超過100%的小鼠屬于抑郁抗性組。在大多數(shù)情況下，超過一半的C57BL/6J小鼠在受到慢性社交挫敗應激時表現(xiàn)出易感表型。角落區(qū)停留時間是社交回避的另一個有用指標，它往往與互動區(qū)停留時間呈負相關（圖4B）。

圖4|社交互動測試的統(tǒng)計分析

  注意事項

1、針對社交挫敗應激籠的設置可以有所不同，還可以根據(jù)籠的形狀和尺寸對分隔器、圓筒等附加設備進行修改或替換。

2、社會挫敗持續(xù)時間（5-10 min）可以根據(jù)CD-1攻擊性小鼠的攻擊性來調(diào)整，以應對適當?shù)纳眢w壓力，避免造成嚴重傷害。仔細觀察每一個過程，替換那些攻擊性太強（持續(xù)留下開放性傷口）或在社交挫敗過程中攻擊性不夠的CD-1小鼠。對嚴重受傷的社交挫敗鼠實施安-樂-死。

3、社會挫敗方案的變化：為了縮短應激周期（例如與病毒表達周期相一致，如HSV）或減少對植入套管的損傷（例如光遺傳學），可以適當縮短社會挫敗應激范式的造模時間。

a.單次最大社交挫敗應激方案（1天）：將小鼠放入CD-1鼠的籠子中5分鐘，然后休息15分鐘；用新的CD-1鼠重復上述步驟至少兩次。

b.短期社交挫敗應激方案（4~5天）：造模小鼠每天經(jīng)歷兩次社交挫敗，持續(xù)4~5天。