X-tremeGENE™轉(zhuǎn)染試劑Protocol和答疑貼

今天Emma女士來和大家一起聊一聊轉(zhuǎn)染，什么是轉(zhuǎn)染呢？

 PART 01 認(rèn)識(shí)轉(zhuǎn)染 

轉(zhuǎn)染——是指將外源基因如DNA、RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，其應(yīng)用越來越廣泛。

圖  |  常見轉(zhuǎn)染技術(shù)原理

PART 02 常見的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù) 

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)主要分為三大類：物理介導(dǎo)法、化學(xué)介導(dǎo)法及生物介導(dǎo)法：

物理介導(dǎo)法 

一般是電穿孔法，適用于極難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率高，但轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率也很高。

化學(xué)介導(dǎo)法 

選用轉(zhuǎn)染試劑與核酸結(jié)合，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。一般轉(zhuǎn)染試劑有以下三種：

• 磷酸鈣：成本低，但轉(zhuǎn)染效率低，重復(fù)性差；

• 陽離子脂質(zhì)體：轉(zhuǎn)染效率較高，但脂質(zhì)體可能改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞毒性較大；

• 非脂質(zhì)體試劑：以脂類為主的多組分試劑，轉(zhuǎn)染效率高，對細(xì)胞毒性低，且可生物降解。

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生物介導(dǎo)法 

病毒載體，轉(zhuǎn)染效率高，但整合到基因組的風(fēng)險(xiǎn)大，基因長度也受限，比較適合構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)的細(xì)胞株。

所以，綜合考慮到高轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性的結(jié)合，請看下圖：

X-tremeGENE™360轉(zhuǎn)染試劑在轉(zhuǎn)染效率和低細(xì)胞毒性方面都勝出了ThermoFisher的Lipofectamine。

相信X-tremeGENE™系列也是大家熟悉的經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑，今天Emma女士再來給大家好好聊聊它。

X-tremeGENE™是Roche公司的注冊商標(biāo)，我司東銳科技今年三月份也榮升為Roche的一級代理商。

X-tremeGENE™系列是非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，此系列轉(zhuǎn)染試劑可以在含血清培養(yǎng)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，不論是用DNA還是RNA轉(zhuǎn)染，也不論是轉(zhuǎn)染普通細(xì)胞系或者難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，都可以很輕松的找到適合的那一款。

請看更詳細(xì)的細(xì)胞類型對應(yīng)表：

用GFP編碼的pcDNA3.1質(zhì)?；蛘邿晒馑孛妇幋a的pCI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了以下細(xì)胞類型對應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑：

?：可以使用；??：推薦使用；???：最佳推薦使用

話不多說，上Protocol干貨！

轉(zhuǎn)染Protocol以轉(zhuǎn)染12孔板中單孔細(xì)胞的量為例

01 平衡試劑 

X-tremeGENE轉(zhuǎn)染試劑、DNA和稀釋液平衡至15~25°C，輕輕Vortex轉(zhuǎn)染試劑；
 

02 稀釋DNA 

用稀釋液稀釋DNA，稀釋液可以選擇無血清或者減血清培養(yǎng)基，稀釋后的濃度為1ug質(zhì)粒DNA/100ul稀釋液（0.01ug/ul），輕輕混勻；
 

03 分裝稀釋后的DNA 

分別吸取4管100ul（含1ugDNA）稀釋液至四支無菌管中，管上分別標(biāo)記1:1、2:1、 3:1、和4:1。建議使用無菌離心管或者組織培養(yǎng)處理過的圓底96孔培養(yǎng)板；

重要貼士：zui低稀釋液的量是100ul，如果低于100ul會(huì)顯著降低轉(zhuǎn)染效率；
 

04  混勻轉(zhuǎn)染試劑和DNA 

分別吸取1、2、3、4ul轉(zhuǎn)染試劑至剛加入100ul稀釋液（含1ugDNA）的四支無菌管中，對應(yīng)的標(biāo)記為1:1,2:1, 3:1, and 4:1，注意轉(zhuǎn)染試劑不要碰觸到塑料管壁，再輕輕混勻；

重要貼士：避免影響轉(zhuǎn)染效率，未經(jīng)稀釋的轉(zhuǎn)染試劑請不要碰觸到塑料管壁，并不要使用硅化處理的吸頭或者吸管。
 

05 形成轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物 

將轉(zhuǎn)染試劑和DNA混合物在15~25°C環(huán)境中孵育15分鐘，形成轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物。

重要貼士：對于某些特殊的細(xì)胞系或者低比例的情況可能需要更長的孵育時(shí)間，如達(dá)到30分鐘。
 

06 轉(zhuǎn)染細(xì)胞 

從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基可以不進(jìn)行更換。以一滴滴加入的方式向細(xì)胞中加入轉(zhuǎn)染試劑/DNA的復(fù)合物。

重要貼士：對于不同的培養(yǎng)容器，加入復(fù)合物的量不同，以12孔板單孔的量為例，每孔中（含1ml細(xì)胞培養(yǎng)基）加入100ul轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物（含1ugDNA）；

加入復(fù)合物后輕輕混勻培養(yǎng)皿或者培養(yǎng)瓶以保證復(fù)合物的均勻分布，如果條件允許，可以使用搖床低速混勻30秒。

一旦在細(xì)胞中加入了復(fù)合物，就無需再像其它轉(zhuǎn)染試劑一樣需要更換新鮮的培養(yǎng)基。
 

07 檢測目的蛋白含量 

轉(zhuǎn)染細(xì)胞后將細(xì)胞繼續(xù)孵育18-72小時(shí)。孵育的時(shí)間受許多因素的影響，如DNA載體、細(xì)胞類型、細(xì)胞密度、細(xì)胞培養(yǎng)基和表達(dá)蛋白的類型。

孵育之后便可以選擇合適的方式進(jìn)行蛋白的檢測，如熒光定量或者免疫印跡等。

雖然我們有無比可靠的轉(zhuǎn)染試劑，但是有時(shí)候?yàn)槭裁催€是會(huì)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不佳的情況呢？

別灰心，這時(shí)候我們需要放大雙眼，來看一下Emma女士列出的要點(diǎn)，逐一排除原因，很快就可以做出理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，會(huì)給您未來發(fā)表的文章增色哦！

PART 03  轉(zhuǎn)染試劑的技術(shù)答疑 

Q：為什么轉(zhuǎn)染效率不高？

 未優(yōu)化*佳的轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例

影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的因素較多，主要包括細(xì)胞生長狀況、傳代次數(shù)、轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例和孵育時(shí)間、質(zhì)粒大小等，其中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例尤為關(guān)鍵。

對于不同的細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的最佳比例也不同。由于不同細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜、核膜等結(jié)構(gòu)存在較大差異，同種轉(zhuǎn)染試劑在不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率也不盡相同。

因此，對于較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞如原代細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞，為提高轉(zhuǎn)染效率，必須對轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例做進(jìn)一步優(yōu)化。

對于X-tremeGENE™系列的轉(zhuǎn)染試劑，我們建議轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例按照1:1、2:1、3:1、4:1（ul：ugDNA）四個(gè)比例進(jìn)行測試，選出適合的比例，對于大多數(shù)細(xì)胞類型，3:1的比例是最合適的。

  細(xì)胞的數(shù)量不夠 

對于大多數(shù)細(xì)胞類型來說，建議在細(xì)胞密度70%-90%之間進(jìn)行轉(zhuǎn)染，過多或者過少都可能降低轉(zhuǎn)染效率。

  未調(diào)整到最佳的孵育時(shí)間 

轉(zhuǎn)染后最佳的孵育時(shí)間為18-72小時(shí)，對于大多數(shù)的細(xì)胞類型和質(zhì)粒來說，最佳的孵育時(shí)間是24-48小時(shí)。

  轉(zhuǎn)染效率受培養(yǎng)基某些組分的抑制 

培養(yǎng)基中一些組分如聚陰離子會(huì)影響轉(zhuǎn)染，保證培養(yǎng)基中無這樣的組分。

  轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物的量過少 

稀釋后DNA的量zui低為100ul，過低的量會(huì)顯著降低轉(zhuǎn)染效率。

Q：為什么轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率太高？

 細(xì)胞密度不適合 

對于大多數(shù)細(xì)胞類型來說，建議在細(xì)胞密度70%-90%之間進(jìn)行轉(zhuǎn)染，過多或者過少都可能降低轉(zhuǎn)染效率。

  細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng) 

對于常規(guī)細(xì)胞來說，無血清培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不夠，會(huì)降低細(xì)胞的存活率，雖然roche的轉(zhuǎn)染試劑可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但考慮到細(xì)胞需要血清營養(yǎng)成分的供給，應(yīng)使用正常培養(yǎng)基或者減血清培養(yǎng)基。

  轉(zhuǎn)染劑/DNA復(fù)合物未和細(xì)胞混合均勻 

應(yīng)該將復(fù)合物以一滴滴緩慢加入的方式加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后輕輕地前后和左右晃動(dòng)，使復(fù)合物均勻分布。

  使用了內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒載體 

質(zhì)粒應(yīng)該保證是高純度無污染的，可以在提完質(zhì)粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣可以起到除菌的效果。

  質(zhì)?；虍a(chǎn)物對細(xì)胞有毒害作用 

高表達(dá)的質(zhì)?；虍a(chǎn)物可能會(huì)使得細(xì)胞本身生長緩慢或者存活率下降。

  使用了過多的轉(zhuǎn)染試劑/DNA復(fù)合物 

陽離子轉(zhuǎn)染試劑濃度過高時(shí)，由于帶有很強(qiáng)的正電荷，對細(xì)胞有一定的毒性，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞大量死亡，所以應(yīng)降低復(fù)合物的濃度或者增加細(xì)胞的濃度。

PART 04   研究方向?qū)?yīng)篇 

快到文末了，如果您還沒選擇好您的轉(zhuǎn)染試劑，也可以按照下面的表格來選擇。

（點(diǎn)擊圖片查看清晰原圖）

如果有更多的問題，歡迎聯(lián)系我們。

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