VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)是通過腳印光亮折射技術(shù)，采用高速攝像機(jī)采集移動(dòng)中的大小鼠行走過程中的足印信息，然后利用我公司自主開發(fā)的足印步態(tài)分析系統(tǒng)自動(dòng)識別分析小鼠的步態(tài)指標(biāo)，以評價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)和空間學(xué)習(xí)能力。評價(jià)指標(biāo)包括：觸地面積、擺動(dòng)速度、擺動(dòng)時(shí)長、制動(dòng)時(shí)長、步行周期、前后肢步寬、正常步序比等等，以此客觀評價(jià)PD模型的步態(tài)改變。

動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)可用于評價(jià)神經(jīng)創(chuàng)傷、神經(jīng)性萎-縮、神經(jīng)疾病、以及疼痛癥狀群的動(dòng)物模型。該系統(tǒng)應(yīng)用范圍包括：脊索損傷、神經(jīng)性疼痛、關(guān)節(jié)炎、中風(fēng)、帕金森病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等疾病的研究。通過步態(tài)分析，了解神經(jīng)源性疾病發(fā)展過程、評價(jià)治療方法的效果和篩選治療藥物。

帕金森氏癥導(dǎo)致肢體動(dòng)作僵硬和協(xié)調(diào)性降低。步態(tài)分析系統(tǒng)通過測量動(dòng)物模型中的腳間距離、擺動(dòng)時(shí)相、支撐方式和正常步序比等參數(shù)評估運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。

摘要

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是全-世-界-范圍內(nèi)第二大神經(jīng)退行性疾病，由于目前并未開發(fā)出前期的診斷方法，在病程中后期已無法根-治，臨床上多采用保守治療，藥物緩解癥狀和手術(shù)輔助治療。目前常用左旋多巴來彌補(bǔ)多巴胺能神經(jīng)元缺失所引起的多巴胺分泌不足，但是這種藥物緩解PD癥狀依賴于多巴脫羧酶的催化而發(fā)揮藥效，隨著晚期PD病人的神經(jīng)元缺失，這種酶也將減少，只能在早期發(fā)揮比較明顯的作用，加大藥量的同時(shí)也將產(chǎn)生更加明顯的副作用，除了增加肝腎負(fù)擔(dān)以外，還會引起不自主運(yùn)動(dòng)和精神錯(cuò)亂等癥狀，因此，繼續(xù)探索PD的發(fā)病機(jī)制，尋找更加合適的藥物靶標(biāo)挽救神經(jīng)元的缺失并探索合適的藥物仍然是探索的方向。

研究背景

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾?。∟eurodegenerative disease），具有不斷演變的復(fù)雜性。是以黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的嚴(yán)重缺失以及路易小體和神經(jīng)突觸內(nèi)含物的積累和擴(kuò)散為主要病理標(biāo)志的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病被認(rèn)為是繼阿爾茨海默病之后第二大的神經(jīng)退行性疾病，成為世界上患者增長速度最快的神經(jīng)退行性疾病，自1990年到2015年的25年間，病患人數(shù)增長已一倍，達(dá)到600多萬。隨著全球老齡化愈加嚴(yán)重，預(yù)計(jì)到2040年，病患人數(shù)將再增長一倍。PD的發(fā)病機(jī)制和病因至今尚未明確， 并沒有任何一種獨(dú)立學(xué)說能夠闡明其分子致病機(jī)制，已經(jīng)證明的分子機(jī)制包括氧化應(yīng)激下活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生、α-突觸核蛋白（α-synuclein）沉積、多巴胺（DA）合成減少或線粒體功能障礙等。主要影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)，臨床癥狀主要包括：1.運(yùn)動(dòng)癥狀：靜止性震顫、僵硬、步態(tài)異常等。2.睡眠障礙、認(rèn)知障礙和抑郁等。

為此，探究 PD 致病機(jī)制，闡明神經(jīng)元缺失的分子機(jī)理或許是突破現(xiàn)有PD治療策略的重要方向。

實(shí)驗(yàn)材料：

1.A53T轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠（品系均為C57BL/6J）。

2.10%酒精用于擦拭步態(tài)玻璃板。

注：75%酒精氣味刺激性大，頻繁使用將導(dǎo)致小鼠不愿通過跑道。

3.衛(wèi)生紙。

4.空籠盒。

行為學(xué)測試步驟包括：

（1）VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)軟件，該軟件從位于t臺跑道下方的攝像機(jī)接收信息，并檢測由于對跑道表面施加壓力(例如，通過放置爪子)而從跑道表面反射的光線。

（2）把老鼠放到t臺的一邊。

（3）通過簡單的按鈕點(diǎn)擊，以電子方式啟動(dòng)系統(tǒng)。

（4）讓動(dòng)物走到跑道的另一邊。

模型建立與藥物處理：

目前PD常用模型有神經(jīng)毒素模型和基因編輯模型，其中神經(jīng)毒素模型應(yīng)用更加廣泛。本課題兩種模型均有涉及，對PD模型A53T轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠，使用小動(dòng)物麻醉機(jī)對小鼠按推薦計(jì)量使用異氟烷進(jìn)行麻醉后固定于腦立體定位儀上，通過顱骨鉆在小鼠顱骨上鉆孔，將顯微注射針植入鉆孔側(cè)大腦紋狀體區(qū)域后，使用 6-OHDA（8 mg/kg）對敲除小鼠紋狀體注射，聯(lián)同使用治療藥物21天。

動(dòng)物生存環(huán)境：

將雌雄小鼠分開飼養(yǎng)每籠4-5只，分籠可避免發(fā)情和交配引起的激素水平改變，影響行為學(xué)的測試。室溫控制在22-25℃，12-12小時(shí)光暗循環(huán)的安靜環(huán)境中。給予充足的食物和飲用水。

Tip：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存環(huán)境一定要安靜， 驚恐狀態(tài)下的小鼠，行為異常，不能反映真實(shí)行為學(xué)指標(biāo)。每組小鼠最好不少于8只，以減少個(gè)體間差異，避免實(shí)驗(yàn)偶然性。選擇12-14周齡小鼠，神經(jīng)退行性疾病小鼠隨著年齡增加，神經(jīng)元缺失更加嚴(yán)重，年齡太大，在病程后期，小鼠無法直立行走，年齡太小，表型不明顯，觀測不到運(yùn)動(dòng)異常指標(biāo)。

提前適應(yīng)環(huán)境：將小鼠提前兩天放入測試環(huán)境空間飼養(yǎng)（最好是將設(shè)備放在飼養(yǎng)環(huán)境測試），更換環(huán)境后，小鼠因?yàn)榭照{(diào)出風(fēng)口方向、光線照射位置、環(huán)境氣味等改變，而表現(xiàn)出焦慮情緒，而PD患者本身就存在非運(yùn)動(dòng)癥狀，環(huán)境可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

設(shè)備調(diào)試：步態(tài)利用的是腳印光亮折射技術(shù)，建議實(shí)驗(yàn)者提前一天在實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)進(jìn)行的同一時(shí)間段調(diào)試設(shè)備。

Tip：白天和夜晚的采光不同，通道的光線明暗對腳印識別至關(guān)重要，最初光調(diào)試設(shè)備就可能要花費(fèi)幾個(gè)小時(shí)。其次是相機(jī)參數(shù)設(shè)置，在多數(shù)神經(jīng)退行性疾病模型中，需要分時(shí)間段進(jìn)行行為學(xué)測試，進(jìn)入步態(tài)軟件設(shè)置標(biāo)尺需要用A4紙畫一個(gè)實(shí)體的標(biāo)尺，在課題進(jìn)行過程中，最好使用同一標(biāo)尺，也不要改變軟件中方框的大小，因?yàn)檐浖峭ㄟ^等比例計(jì)算擺動(dòng)距離、步長、前后肢間距等長度相關(guān)指數(shù)，只有在同一標(biāo)尺下，不同時(shí)間段的指標(biāo)才有比較的意義。

測試前訓(xùn)練：步態(tài)分析的測試前訓(xùn)練是必要的，將實(shí)驗(yàn)鼠放入步態(tài)跑道上，第一次上跑道可將同籠鼠一起放入跑道5-10分鐘，保持安靜環(huán)境下，不進(jìn)行測試，當(dāng)老鼠通過通道，它會記住有一個(gè)出口可以回到籠子里和同伴待在一起，這將會是老鼠真正通過通道的動(dòng)機(jī)。然后分別將實(shí)驗(yàn)小鼠放入跑道一端，將另一端用擋板封堵，在電腦前等待小鼠進(jìn)入錄像區(qū)域開始記錄。

Tip：測試開始時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠并不能很好適應(yīng)環(huán)境，在驚恐狀態(tài)下不會馬上通過通道，切勿驅(qū)趕、恐嚇方式促使小鼠通過跑道，一只老鼠幾乎不會停留在玻璃板上超過20分鐘不動(dòng)，可能測試兩三百只才回出現(xiàn)一次。在陌生環(huán)境中食物引誘的方法也不可取。在一個(gè)新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因?yàn)檫@可能讓他們覺得會威脅到健康。老鼠是全-球-最-成功的物種之一，它們非常聰明，通常會避免嘗試任何新事物，除非是為了獲益而承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)。通過限制飼養(yǎng)糧食的量，每次通過通道后，通過獎(jiǎng)勵(lì)小食物顆粒來刺激動(dòng)物穿過人行道，也有研究者這樣操作。絕大多數(shù)(>95%)的小鼠在經(jīng)過1-2周的訓(xùn)練后（動(dòng)物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次），就能夠迅速地連續(xù)跑過步態(tài)設(shè)備的玻璃板。這可能是小鼠天生的探索天性所使然。特別注意介紹步態(tài)相關(guān)文獻(xiàn)中都強(qiáng)調(diào)了小鼠是在自愿狀態(tài)下通過通道，記錄真實(shí)的步態(tài)的。

在自然界中老鼠作為獵物，主要生活在地下，遠(yuǎn)離光線的環(huán)境中，老鼠是典型的膽小動(dòng)物，任何外界施加的壓力都有可能擾亂研究結(jié)果。強(qiáng)烈建議，在進(jìn)行任何行為測試，實(shí)驗(yàn)者可以多花點(diǎn)時(shí)間接觸自己的小鼠，以便它們熟悉人類接觸。在隨后的行為測試中，習(xí)慣于被研究人員拿起，突然被拿起來比安靜待在籠子里的老鼠焦慮得多。當(dāng)然，不建議實(shí)驗(yàn)者抓著老鼠的尾巴將它提起，這是老鼠最敏感的部位之一。在籠子里觀察到實(shí)驗(yàn)小鼠的任何與焦慮相關(guān)的行為（打架、理發(fā)、過度梳理）也很重要，并在必要時(shí)采取措施進(jìn)行干預(yù)。如果觀察到打斗，可以將發(fā)起攻擊的老鼠隔離并移出籠子。

不要俯視老鼠，不管你從哪個(gè)角度看著老鼠，它都會誤以為是捕獵者，不要嘗試推它或者恐嚇?biāo)屗白?，這會使它更不愿意行走。相反，如果你將它放在通道上，不被人注意到，在比較封閉的步態(tài)系統(tǒng)中它將會自由行走。

在一個(gè)新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因?yàn)檫@可能會威脅到它們的健康。請記住，老鼠是全-球-最-成功的物種之一，它們非常聰明，他們通常會避免嘗試任何新事物，除非他們能承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)，并能從結(jié)果中獲益。

在進(jìn)行正式的行為學(xué)測試之前，研究者必須要熟悉設(shè)備和軟件，VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)使用起來非常直觀和簡便。只需要多進(jìn)行幾次測試，確保在正式測試時(shí)能夠熟悉操作儀器和軟件。

用擋板擋住通道回到小鼠籠的出口，將實(shí)驗(yàn)小鼠放置在通道入口，回到電腦前等待小鼠通過相機(jī)測試區(qū)域，不要嘗試反復(fù)將小鼠放在同一位置開始，然后通過通道后又拿回起點(diǎn)，這樣反復(fù)操作，小鼠會誤以為自己的行為是錯(cuò)誤的，導(dǎo)致它更長時(shí)間的停留。只需要將小鼠放置在入口，然后等待小鼠在玻璃板上來回行走時(shí)做好記錄即可。記錄數(shù)據(jù)時(shí)，在讓軟件上有“從右至左”和“從左至右”的選擇，小鼠將在通道上來回行走，建議每只小鼠測5次以上，保證有清晰記錄的圖像記錄。收集每只老鼠的多次連續(xù)的行走，并對這些行走進(jìn)行平均分析，這可以減少實(shí)驗(yàn)誤差。讓每個(gè)實(shí)驗(yàn)老鼠多跑三次只需要多花幾分鐘，但是這對準(zhǔn)確了解實(shí)驗(yàn)小鼠的總體步態(tài)有很大的幫助。

測試過程中，實(shí)驗(yàn)鼠隨時(shí)會有大小便，使用10%酒精擦拭玻璃板，并迅速擦干，避免糞便污漬影響實(shí)驗(yàn)。老鼠是嗅覺十分敏感的動(dòng)物，在行為學(xué)測試過程中，老鼠發(fā)現(xiàn)擋板和玻璃板上有其他不熟悉的味道，都會導(dǎo)致老鼠停止前進(jìn)，分散注意力。

Tip：開始的前幾只小鼠，需要立即進(jìn)行步行分析，查看行為學(xué)測試結(jié)果有幾十個(gè)指標(biāo)被檢測，通過傳統(tǒng)的一次測試用一個(gè)表格導(dǎo)出數(shù)據(jù)不方便統(tǒng)計(jì)，通過與步態(tài)售后工程師溝通，開發(fā)了將一次實(shí)驗(yàn)所有檢測指標(biāo)匯總成同一表格內(nèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，大大簡潔了統(tǒng)計(jì)過程。進(jìn)圖、壓力圖、步序圖等參數(shù)是否可以正常記錄。

測試時(shí)間盡量保證在同一時(shí)間段進(jìn)行，白天光照強(qiáng)，到夜晚可能需要重新調(diào)整通道的兩種LED燈亮度，重新檢查各項(xiàng)參數(shù)是否正常，將增加不必要的時(shí)間成本。其次，老鼠的運(yùn)動(dòng)活躍程度可能與晝夜節(jié)律有關(guān)。

測試過程中盡量不要說話和產(chǎn)生噪音，特別是老鼠痛苦時(shí)發(fā)出的吱吱聲，最好是在有舒緩的背景音樂狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正常情況下，老鼠受到驚嚇和噪音都會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠本能停止，在奔跑過程中老鼠會因?yàn)槠渌曇魰簳r(shí)停止前進(jìn)。

不同時(shí)間點(diǎn)檢測同一項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)鼠行為學(xué)參數(shù)，必須保證相機(jī)參數(shù)和標(biāo)尺一致，才有可比性。

行為學(xué)測試結(jié)果有幾十個(gè)指標(biāo)被檢測，通過傳統(tǒng)的一次測試用一個(gè)表格導(dǎo)出數(shù)據(jù)不方便統(tǒng)計(jì)，通過與步態(tài)售后工程師溝通，開發(fā)了將一次實(shí)驗(yàn)所有檢測指標(biāo)匯總成同一表格內(nèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，大大簡潔了統(tǒng)計(jì)過程。

擺動(dòng)時(shí)長（Swing Duration）：擺動(dòng)時(shí)長會隨著速度的增加而減少，同時(shí)也有一個(gè)限度。關(guān)節(jié)炎動(dòng)物可能會因?yàn)殛P(guān)節(jié)機(jī)動(dòng)性的損失而使擺動(dòng)時(shí)長增加。疼痛狀態(tài)下擺動(dòng)時(shí)長會增加，較長的前肢擺動(dòng)持續(xù)時(shí)間可以提供給小鼠充分的機(jī)會讓其在負(fù)載前進(jìn)行臂肢放置。

擺動(dòng)百分比（% Swing）: 假設(shè)整個(gè)步幅時(shí)長（Stride Duration）是*，那么X%是腳爪接觸（ stance）， Y%是非腳爪接觸（ swing）。X% stance+Y% swing=100% stride。典型的% swing大約為35%；此數(shù)值在加速狀態(tài)下會明顯增加。

步幅長度（Stride Length）：同一腳爪的連續(xù)步幅之間的距離，正常狀態(tài)下，給定動(dòng)物的4個(gè)腳爪的此項(xiàng)數(shù)值幾乎相等。胎兒期和初生期給予酒精會導(dǎo)致步幅長度顯著地變短，當(dāng)嚙齒動(dòng)物行走速度提高，步幅長度也會提高，觸地時(shí)長會減少，有關(guān)節(jié)炎的小鼠同樣會有較短的步幅長度。

觸地寬度（Stance Width）：一般地，前肢的觸地寬度會小于后肢的觸地寬度，此距離和身體尺寸有依賴性。更大或者更小的數(shù)值可能指示為穩(wěn)定性而進(jìn)行的姿勢調(diào)整。人類會因?yàn)檩^少穩(wěn)定而避免狹窄的腳步寬度。觸地寬度有時(shí)候被稱為“支撐基礎(chǔ)”。

腳爪面積（Paw Area）：腳爪面積可以指示足底放置范圍作為神經(jīng)損傷、體肢負(fù)載能力和疼痛程度的依據(jù)。例如，有慢性疼痛癥的大鼠表現(xiàn)出有前后腳爪面積的改變。在Huntington舞蹈病的轉(zhuǎn)基因模型上，后肢腳爪面積較小，但是在唐氏綜合癥模型上卻無變化。

步幅時(shí)長（Stride Duration）：小鼠在正常步行速度下的主導(dǎo)踏步模式是交替形式的，步幅時(shí)長取決于運(yùn)動(dòng)速度和步幅頻率。所有體肢的步幅時(shí)長通常情況下是基本相等的。