生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)之微生物的檢測方法

檢測依據(jù)：
      GB/T 5750.2-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 水樣的采集和保存
      GB/T 5750.12-2006 生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)

本文主要包含
   1. 生活飲用水中的微生物指標(biāo)
   2. 水樣采集規(guī)則及注意事項(xiàng)
   3. 菌落總數(shù)、總大腸菌群、耐熱大腸菌群、大腸埃希氏菌的測定方法
   4. 對所檢測水樣的綜合分析

生活飲用水中的微生物指標(biāo)

菌落總數(shù)

水樣在營養(yǎng)瓊脂上有氧環(huán)境下，37℃培養(yǎng)48h后，所得1mL水樣所含菌落的總數(shù)。

檢測意義：作為一般性污染的指標(biāo)，即評價被檢樣品的微生物污染程度和安全性。水樣菌落總數(shù)越多，說明水被微生物污染程度越嚴(yán)重，病原微生物存在的可能性越大，但不能說明污染的來源。

總大腸菌群

指一群在37℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。

檢測意義：作為糞便污染的指標(biāo)。水樣總大腸菌群的含量，表明水被糞便污染的程度，而且間接地表明有腸道致病菌存在的可能。

耐熱大腸菌群

指一群在44-44.5℃培養(yǎng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。我國習(xí)慣上稱之為“糞大腸菌群”。

微生物指標(biāo)常規(guī)檢驗(yàn)流程圖

一、水樣采集

采樣原則：所采集的樣品具有代表性。

采樣容器：不能是新的污染源：不吸收或吸附某些待測組分不與待測組分發(fā)生反應(yīng)。保證從采樣到分析期間樣品各組分的濃度不發(fā)生改變。

微生物樣品必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證在運(yùn)送、貯存過程中不受污染。

自來水水樣：先將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌再開放水龍頭使水流5min(經(jīng)常用水的水龍頭放水1~3min)后，采集水樣于無菌玻璃瓶，約占瓶容量80%，以便搖勻水樣。

水源水水樣：選有代表性的地點(diǎn)及可疑地方，一般距水面下10-15cm采集，采樣后在水中改好蓋子，再從水中取出。

注意事項(xiàng)

1. 嚴(yán)格無菌操作。

2. 做好標(biāo)記：采得水樣后應(yīng)立即記錄水樣名稱、地點(diǎn)、時間等內(nèi)容。

3. 從速送檢。水樣從采集到檢驗(yàn)不應(yīng)超過2h，在4℃下保存不應(yīng)超過24h。

二、菌落總數(shù)測定

所需培養(yǎng)基和試劑：營養(yǎng)瓊脂、9mL無菌生理鹽水管。

自來水水樣檢測

操作步驟：

1. 以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1mL充分混勻的水樣，注入滅菌平皿中。

2. 傾注約15mL已融化井冷卻到45℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿；使水與培養(yǎng)基充分混勻（每次檢驗(yàn)時應(yīng)做一平行接種，同時另用一個平只傾注營養(yǎng)瓊脂養(yǎng)基作為空白對照）

3. 待冷卻凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即為水樣1mL中的菌落總數(shù)。

4. 培養(yǎng)完成后，用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。

結(jié)果分析與報(bào)告：

計(jì)算平均菌落數(shù)，若菌落總數(shù)(CFU/mL)當(dāng)檢樣的菌落數(shù)為1~100時，按實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時，采用二位有效數(shù)字報(bào)告。

國家標(biāo)準(zhǔn)(GB5749-2006)規(guī)定生活飲用水菌落總數(shù)每毫升不得超過100個。

水源水檢測

操作步驟：

1. 以無操作方法吸取1mL充分混勻的水，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:10稀釋液。

2. 吸取1:10的稀釋液1mL，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:100稀師液，按同法依次稀釋成1:1000，1:1000釋液等備用（如此遞增稀釋一次，必須更換一支1m滅菌管）。

3. 然后用無菌極管取稀釋的水樣和2個~3個適釋度的水樣1mL，分別注入滅菌平皿內(nèi)。之后操作同自來水水樣的檢驗(yàn)步驟。

結(jié)果分析與報(bào)告：計(jì)算平均菌落數(shù)，首先選擇平均菌落在30~300之間者進(jìn)行計(jì)算。

一般水源水中菌落總數(shù)與水清潔程度的關(guān)系：

注意事項(xiàng)

1. 菌落總數(shù)測定中，應(yīng)選擇合適的稀釋度進(jìn)行(生活飲用水，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定每毫升不得超過100個，因此以直接吸取1毫升到平板進(jìn)行培養(yǎng))

2. 各稀釋管、相應(yīng)半皿做好標(biāo)記。包括：水樣名稱、稀釋度、時間、小組。

3. 嚴(yán)格無菌操作進(jìn)行水樣稀釋時，每一稀釋度均需更換吸管。

4. 傾注時，要注意營養(yǎng)瓊脂的溫度。

5. 傾入瓊脂后要混勻，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)。

三、總大腸菌群測定

所需培養(yǎng)基和試劑：乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。

多管發(fā)酵法步驟：

初步發(fā)酵試驗(yàn)：采用乳糖蛋白培養(yǎng)液36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。

平板分離：對陽性管培養(yǎng)物，接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基觀察菌落特征，并進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢。

復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗(yàn)：對典型和可疑菌落，接種于乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵證實(shí)試驗(yàn)。

結(jié)果報(bào)告(MPN)：根據(jù) GB 5750.12-2006 所附檢索表報(bào)告結(jié)果。

四、耐熱大腸菌群測定

所需培養(yǎng)基和試劑：乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC肉湯、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基

多管發(fā)酵法步驟：

初步發(fā)酵試驗(yàn)：采用乳糖蛋白培養(yǎng)液36℃±1℃培養(yǎng)24h觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。

耐熱培養(yǎng)：陽性管接種在EC肉湯管中，44.5℃培養(yǎng)24h觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況。

平板培養(yǎng)：陽性管接種在EMB平板上，36℃±1℃培養(yǎng)24h。

結(jié)果報(bào)告(MPN)：根據(jù) GB 5750.12-2006 所附檢索表報(bào)告結(jié)果。

五、大腸埃希氏菌測定

所需培養(yǎng)基和試劑：EC-MUG培養(yǎng)基

多管發(fā)酵法步驟：

耐熱培養(yǎng)：將總大腸菌群初發(fā)酵中產(chǎn)酸或產(chǎn)氣的管進(jìn)行大腸埃希氏菌檢測，接種此類試管中的液體到EC-MUG管中，在培養(yǎng)箱或恒溫水浴中44.5℃培養(yǎng)24h。如使用恒溫水浴，在接種后30min內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，使水浴液面超過EC-MUG管的液面。

結(jié)果報(bào)告(MPN)：
   將培養(yǎng)后的EC-MUG管在暗處用366nm紫外燈照射，如有藍(lán)色熒光，則表明水樣中含有大腸埃希氏菌。
   計(jì)算EC-MUG陽性管數(shù)，根據(jù)GB 5750.12-2006所附檢索表報(bào)告結(jié)果。