一文讀懂顯微注射法的原理及應用

將外源基因導入靶細胞的方法有很多，其中一種比較普適、成功率又比較高的方法為顯微注射法。

首先，我們說說這種方法的原理：顯微注射法即是利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)，實現(xiàn)宿主細胞的基因改造。

一般的動物細胞，直徑大約10微米左右；人類真核細胞直徑范圍在：3～30微米，其中人卵細胞直徑約為100微米。故直徑為0.2微米的顯微注射器針頭可以為各種類型和任意大小的動物細胞提供精準的、重復性良好的細胞內(nèi)和細胞旁注射。在注射的過程中，動物細胞膜也會被刺破。但因為動物細胞膜良好的彈性和流動性，在細胞膜被刺破以及細胞內(nèi)注入或者抽取點物質之后，細胞膜還是可以恢復完整的，恢復好的細胞可以繼續(xù)存活，正常生長。當然操作手法也會影響實驗的成功率，針對不同細胞的操作手法方面的研究，現(xiàn)在也有很多文章發(fā)表出來。

顯微注射技術的長處為：任何DNA在原則上均可傳入任何種類的動物細胞內(nèi)，對于所轉的外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數(shù)百kb的DNA片段均可以成功轉入靶細胞并整合進其染色體組。操作過程如圖所示：

接下來，我們再說說顯微注射器針頭的制作：顯微注射過程中使用的微量移液管是用微電極拉制儀來制作的，先將玻璃毛細管加熱到其熔化的溫度，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關，它可以用于精準的移液。

   SUTTER微電極拉制儀P-000                                                日本NARISHIGE拉制儀PC-100

顯微注射器的結構如下圖所示：

注射器中加好需要注射的樣品之后，通過運用顯微注射儀（壓力注射）可以獲得將微量移液管中的物質擠噴入靶細胞中。

日本NARISHIGE顯微注射儀IM-400                                                        美國warner顯微注射儀PLI-100A

現(xiàn)在，我們來歸納一下顯微注射法的應用：

（一）顯微注射法可用來做轉基因動物：顯微注射技術是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受體細胞的基因組內(nèi)，再通過胚胎移植技術將整合有外源基因的受精卵移植到受體動物的孑宮內(nèi)發(fā)育，從而獲得轉基因動物。顯微注射法是目前轉移效率基較好的一種基因轉移方法，可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進行轉移；外源基因的長度不受限制, 可達100kb ；實驗周期相對比較短。它的不足之處是 ：導入外源基因整合位點和拷貝數(shù)無法控制；常導致插入位點附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變，可造成動物嚴重的生理缺陷。盡管如此，由于顯微注射技術直接對基因進行操作，整合率較高，因而仍是目前建立轉基因動物極為重要的方法。

（二）顯微注射法在植物、動物的細胞發(fā)育研究的應用：將特定的分子探針及衍生的細胞間質成分導入活體細胞，為研究控制細胞功能的調控機制提供了新的視野。

（三）顯微注射法用于做克隆動物：供體細胞的細胞核用顯微注射器移入卵母細胞后，在卵母細胞相關因子的作用下，發(fā)生了重編程回復到發(fā)育的起點狀態(tài)。核重編程的過程就是使在體細胞中被關閉，而在正常胚胎發(fā)育中表達的基因重新被激活的過程。

重編程有三種可能的結果：

1，供核基因組沒有進行重編程，重構胚很快死亡；

2，部分重編程，重構胚在不同的發(fā)育階段死亡 ；

3，重編程，產(chǎn)生正常的克隆動物。

（四）顯微注射器可以實現(xiàn)單細胞提?。涸诓桓淖兗毎姝h(huán)境的情況下，用顯微注射器對單個細胞進行活細胞提取?？蓡为毺崛〖毎|或細胞核，或者同時提取提取細胞質和細胞核。提取后細胞仍可存活。相比于傳統(tǒng)的裂解方式，用顯微注射器提取的樣本更為干凈，可以得到很好地電鏡圖像。

（五）顯微注射法可以實現(xiàn)更優(yōu)的CRISPR-Cas轉染方式：顯微注射器能夠進行高速、高效地將CRISPR-Cas復合物注入細胞，幫助您克服對于傳統(tǒng)方式極難轉染的細胞基因編輯問題。

我們再介紹一下顯微注射法的具體操作過程，顯微注射實驗的操作需要在顯微鏡下進行，如圖所示：

（一）在注射針內(nèi)裝液：使用無菌的微量加樣器從微注射針的后部加入待注射樣品。

（二）注射針安裝和定位：

1， 將裝液后的針頭的游離端安在連接器上，然后旋緊連接器以固定針頭，再將其固定到微操作儀的托針管上。

2， 把載有待注射樣本的培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺上，用低倍物鏡對準細胞調焦；

3， 移動針頭并在顯微鏡下調整微操作儀，直到針頭的陰影在視野的中心上方；

4， 使用工作用放大倍數(shù)，調準細胞焦距，找到針尖。

（三）顯微注射：

1，使針尖對準細胞的待注射部位（細胞與針尖在同一焦面上），旋轉推進旋鈕，針刺入細胞內(nèi)（卵膜、細胞膜、核膜）。

2， 旋轉加樣旋鈕，將樣本加入，并離開細胞。

余下，就是將操作好的細胞放回好好培養(yǎng)，實驗結束。

顯微注射法的缺點是：實驗所需的設備精密而昂貴、操作技術需要長時間的練習，以及每次只能注射有限的細胞。