在流式檢測中為什么低吸附磁性熒光編碼微球的檢測效果會更好

流式熒光技術(shù)又稱懸浮陣列、液相芯片等，是近年來逐漸發(fā)展起來的多指標(biāo)聯(lián)合診斷技術(shù)。該技術(shù)以熒光編碼微球為核心，集流式原理、激光分析、高速數(shù)字信號處理等多種技術(shù)于一體，多指標(biāo)并行分析。該項技術(shù)其不僅擁有化學(xué)發(fā)光高靈敏度、高精密度的優(yōu)勢，同時還具備高通量、快速、并行檢測等特點，既可適用于臨床檢驗也適用于科研，而且檢測時對樣本需求量極少，特別適合一些珍貴樣本的多指標(biāo)分析。此外，平臺具有良好的開放性和拓展性，用戶可根據(jù)自己的需求來設(shè)計和實現(xiàn)對不同目標(biāo)分子的聯(lián)合檢測。

盡管流式熒光技術(shù)能同時檢測多種抗原，但在研發(fā)中可能會遇到一種情況：采用流式熒光法檢測單一或少數(shù)幾種指標(biāo)能實現(xiàn)高靈敏檢測，然而當(dāng)指標(biāo)數(shù)進一步增加時，原本某一個本來靈敏度很高的指標(biāo)可能會出現(xiàn)目標(biāo)抗原濃度為0的標(biāo)樣的檢測熒光值突然升高而導(dǎo)致靈敏度顯著下降的情況。以下是我們在開發(fā)多細(xì)胞因子檢測試劑時遇到的一個真實的例子：圖1（a）為我們構(gòu)建一個9個細(xì)胞因子聯(lián)檢時做標(biāo)曲，其中的TNF-a的標(biāo)準(zhǔn)曲線。從結(jié)果中可知即使當(dāng)抗原濃度低至3.4 pg/mL也在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)。此時，我們再增加一個細(xì)胞因子（共10因子），此時，再對TNF-α驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線時，會發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度為零的標(biāo)樣熒光檢測值顯著升高（MFI從原來的142增加至984，相同的儀器，同樣的測試條件），隨之而來的是標(biāo)曲的線性范圍覆蓋下限明顯不足（b）。

                         圖1 （a）9因子檢測時TNF-α的標(biāo)曲；（b）增加到10因子檢測時TNF-α的標(biāo)曲

  當(dāng)然，這是一個比較特別的例子，不一定在所有的實驗中都會出現(xiàn)這樣急劇增高的現(xiàn)象。然而，我們還是經(jīng)常會遇到隨著檢測目標(biāo)抗原種數(shù)的增加，抗原濃度為0的標(biāo)樣中檢測熒光值會逐漸升高的情況，只是升高得沒那么顯著。

  接下來，讓我們來思考一下，為什么隨著檢測目標(biāo)抗原種數(shù)的增加，個體微球群在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時的標(biāo)樣檢測熒光值會增加呢？不難想到，這個主要是由于微球與熒光檢測抗體間發(fā)生非特異性吸附導(dǎo)致的（我們把這種由于微球和熒光檢測抗體通過非特異性吸附產(chǎn)生的熒光增值叫做噪音，示意圖如圖2）。隨著聯(lián)檢項目的增加，熒光檢測抗體的種數(shù)也會隨之增加，故而通過非特異性吸附，結(jié)合到個體微球群的熒光檢測抗體也會增加，也就是噪音也會增加。

                                                  圖2 微球上的噪聲示意圖

     這種情況對一些要求靈敏度較高的檢測項目明顯是不利的。此外，由于熒光檢測抗體與個體微球群之間的吸附是一種比較弱的結(jié)合力，容易受到多種因素的影響而產(chǎn)生波動。因此，當(dāng)用于血清樣本檢測時，血清中存在的各種蛋白質(zhì)會與熒光檢測抗體競爭微球的非特異性吸附位點，最終的結(jié)果是導(dǎo)致檢測到的熒光信號不能正確的對應(yīng)血清中各抗原的濃度，這種影響在含低濃度抗原的血清中尤為明顯。以細(xì)胞因子檢測試劑盒為例，我們會發(fā)現(xiàn)對一些正常人血清進行細(xì)胞因子檢測時，很大概率會出現(xiàn)熒光檢測值低于對照品為0的標(biāo)樣，從而算不出細(xì)胞因子的濃度（圖3為細(xì)胞因子檢測出現(xiàn)負(fù)值的原因分析示意圖3）。從我們掌握的數(shù)據(jù)來看，即使是一些主流的進口多細(xì)胞因子試劑，對正常人血清各個因子的檢測率不到50%。

圖3 在噪音高時，低值血清樣本檢測熒光值出現(xiàn)負(fù)值的原因分析示意圖

    有沒有好的方法去降低噪音呢？針對這個問題，碧芯生物科技開發(fā)出低吸附磁性熒光編碼微球，這種微球經(jīng)過特殊的工藝處理，對熒光檢測抗體的非特異性吸附非常低。那么如果采用這種微球做試劑，圖1所出現(xiàn)的問題能否得到解決呢？接下來我們又做了實驗，用低吸附磁性熒光編碼微球替代圖1中使用的普通磁性熒光編碼微球，同樣做成10因子檢測試劑盒，我們驚喜的發(fā)現(xiàn)，TNF-α微球群噪音值得到明顯的改善，由原來的844降低到6，與之對應(yīng)的是標(biāo)準(zhǔn)曲線覆蓋的濃度范圍又可以低至3.4 pg/mL了

   最后我們對比了采用低吸附微球構(gòu)建的12細(xì)胞因子檢測試劑與進口七因子檢測試劑在噪聲方面的差異，如圖所示，采用碧芯生物生產(chǎn)的低吸附磁性熒光微球生產(chǎn)的12細(xì)胞因子檢測試劑的噪聲不到進口同類試劑的5%（圖5）。通過降低噪音，碧芯生物12因子檢測試劑顯著提升了各個細(xì)胞因子對于正常血清的檢出率，各因子檢出率均高于90%。

                                     圖5碧芯生物試劑與某進口th1/th2/th7七因子檢測試劑噪聲對比