代謝組學 | GC-Orbitrap/MS—— 小分子識別定量必備

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李丕  邢江濤

代謝組學旨在對給定生物學背景下的所有代謝物（小分子）進行識別和定量。質(zhì)譜法是對小分子進行準確分析的最強大工具之一，可以檢測成百上千種代謝物。然而，由于數(shù)據(jù)庫覆蓋范圍有限及代謝組的復雜性，通常只有不到30%的化合物被鑒定，而未注釋的峰很可能是感興趣化合物。因此未知物識別一直是代謝組學研究中最耗時的步驟，依賴質(zhì)譜專家對數(shù)據(jù)進行勞動密集型的手動注釋。

本文將從分辨率和質(zhì)量精度、同位素過濾、CI確認、靈敏度、動態(tài)范圍、解析軟件這6個維度討論GC-Orbitrap/MS在代謝組學中小分子識別和定量的表現(xiàn)。

01

未知物注釋—— HRAM

近十年來隨著 GC-Orbitrap/MS 高分辨氣質(zhì)系統(tǒng)的興起，整個代謝組進入快速注釋的新時代。這得益于GC-Orbitrap/MS超高分辨率（高達240K）和亞ppm質(zhì)量精度的優(yōu)點。采集樣本生成高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后利用離子質(zhì)量虧損遞推計算出未知峰所有可能的分子式。分辨率是分離兩個m/z相近離子的能力，質(zhì)量精度是實測值和理論值的偏差。分辨率和質(zhì)量精度越高，滿足篩選條件的分子式越少，越容易得到正確注釋。

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Misra使用 GC-Orbitrap/MS 分析了標準參考物質(zhì) NIST SRM 1950 混合血漿參考樣品，以評估該平臺對常規(guī)發(fā)現(xiàn)代謝組學在代謝物注釋和定量方面的適用性[1]。該研究分別通過EI、PCI 和 NCI 模式自信地鑒定了 263、93 和 65 種代謝物（代謝組學標準倡議MSI置信水平 2），其中 270 種代謝物 (64%) 使用內(nèi)部譜庫進行了驗證。另外，與使用相同 NIST SRM 1950 血漿樣品的已發(fā)表的基于LC-MS 的工作相比，兩個平臺只有 17% 的代謝物重疊，說明了血漿代謝組學研究中使用GC-Orbitrap/MS 平臺的互補性和必要性。

02

未知物注釋——同位素模式過濾

在高m/z區(qū)域，僅靠高質(zhì)量精度不足以排除足夠多的候選物，因為高m/z區(qū)域存在更多化學上可能的分子式。研究表明同位素模式正交過濾可以排除>95%的錯誤候選物。

Qiu使用加標的同位素比率離群值分析 (IROA) 進行未知代謝物注釋[2]，并證明使用該工作流程生成化學式的可靠性更高。本質(zhì)上，IROA 工作流程使用兩種不同的 13C 富集碳源（隨機 95% 12C 和 95% 13C）以產(chǎn)生鏡像同位素峰對，二者的質(zhì)量差異揭示了碳鏈長度 (n)，從而有助于鑒定內(nèi)源性代謝物。通過GC-Orbitrap/MS數(shù)據(jù)可以識別 244 個 IROA 峰對，平均質(zhì)量偏差為1.48 ppm，這顯著提高了 IROA 的檢測能力（Qiu 之前的工作使用其他類型的高分辨質(zhì)譜，僅得到 126 個 IROA 峰對，平均質(zhì)量偏差為 32.2 ppm）。  

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未知物注釋——EI+CI互補

元素組成的計算需要豐富的分子離子。EI譜圖通常分子離子豐度低或缺失，因此需要使用 CI軟電離獲得分子離子信息。很多研究都使用GC-Orbitrap/MS 結合CI電離為顯著失調(diào)的未知物生成可能的分子式，此處不贅述。

Misra在其研究論文中對GC-Orbitrap/MS輕松切換EI/CI源的功能給予了中肯評價。他提到，對于我們的高分辨 GC-Orbitrap/MS 儀器，EI 和 CI 之間的切換很容易，一個制備好的樣品可以依次運行 EI-MS、PCI-MS/MS 和 NCI-MS分析。

賽默飛具有獨特的VPI技術，可以在不破壞質(zhì)譜真空的情況下2分鐘之內(nèi)切換EI源和CI源，5分鐘內(nèi)更換色譜柱，消除宕機時間，輕松實現(xiàn)EI/PCI聯(lián)合定性或雙柱RI定性。更有EI/CI混合離子源，一個離子源實現(xiàn)三種電離模式。

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高靈敏度——小樣本量發(fā)現(xiàn)更多標志物

研究表明，GC-Orbitrap/MS在代謝組學中的靈敏度和發(fā)現(xiàn)標志物的數(shù)量遠遠高于四極桿質(zhì)譜[3]。若要在兩種儀器得到的響應強度相近的TIC，需要在 四極桿質(zhì)譜上注入濃度高 8 倍的樣品。以相同參數(shù)對數(shù)據(jù)進行峰拾取、分組、過濾后，分別剩下 114 個（四極桿）和 339 個化合物（GC-Orbitrap/MS）——這是 3 倍的差異。這表明GC-Orbitrap/MS的靈敏度更高，使用更小的樣本量即可增加代謝覆蓋率。

可用樣本量對于環(huán)境樣本或可擴展培養(yǎng)的生物體不是問題，但可能是人類或動物研究的限制因素。更重要的是，在樣品濃度降低 8 倍的情況下，GC-Orbitrap/MS 仍檢測生成了幾乎 3 倍的代謝物。

比較兩種儀器中顯著失調(diào)的化合物，有趣的是，兩個數(shù)據(jù)集的重要化合物只有 28% 重疊。在四極桿數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)缺失46個失調(diào)化合物，而 GC-Orbitrap/MS 數(shù)據(jù)集僅缺失9個失調(diào)化合物。四極桿缺失的化合物中， 4個由于解卷積錯誤而缺失；12個由于p 值或倍數(shù)變化不符合重要化合物的閾值標準而缺失；29個因檢測到的碎片太少缺失。由此可見，GC-Orbitrap/MS 可以檢測到更多的化合物，因為它的檢測限較低。此外，GC-Orbitrap/MS缺失的9種化合物中有2個被排除是因為它們存在于培養(yǎng)基空白中；2個解卷積錯誤缺失，5個因 p 值或倍數(shù)變化不符合重要化合物的閾值標準。

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05

動態(tài)范圍

代謝組學的一個關鍵挑戰(zhàn)是生物樣品中代謝物濃度的動態(tài)范圍較大，跨越4-6 個數(shù)量級。對于傳統(tǒng)光電倍增器式質(zhì)譜檢測器，很容易導致飽和。

GC-Orbitrap/MS是一種新型高分辨質(zhì)譜儀，動態(tài)范圍高達6個數(shù)量級。因此GC-Orbitrap/MS允許引入更多的樣品，從而獲得更多的低豐度代謝物。在Qiu的研究中，GC-Orbitrap/MS 具有更寬的動態(tài)范圍，因此可以檢測到更多的 IROA 峰對，結合GC-Orbitrap/MS的高分辨率，共同提高了分子式的可靠性。

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呼吸氣檢測可以揭示人體的揮發(fā)性代謝組，是疾病早期診斷和精準醫(yī)學的有效工具。Boyle采用熱脫附（TD）與 GC-Orbitrap/MS 聯(lián)用搭建Breath Biopsy呼吸活檢平臺（Owlstone Medical），將呼吸樣本收集、熱解吸和測量聯(lián)系起來，以提供呼吸樣本的綜合概況。GC-Orbitrap/MS 高分辨率質(zhì)譜儀與呼吸活檢結合使用的主要優(yōu)勢在于動態(tài)范圍寬、質(zhì)量分辨率高和質(zhì)量準確度高，可實現(xiàn)低濃度和高濃度下的檢測和定量以及快速可靠的化合物鑒定。同一呼吸樣本中可能含有非常高和超痕量（飛克）水平的化合物，因此獲取廣泛豐度范圍內(nèi)的高質(zhì)量數(shù)據(jù)至關重要。超過6個數(shù)量級動態(tài)范圍使 GC-Orbitrap/MS 輕松勝任呼吸活檢（見下圖）。

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另外，呼吸分析通常受到樣本數(shù)量的限制，因此必須從單一分析中收集定量和定性信息。GC-Orbitrap/MS能夠進行平行的靶向和非靶向分析，從而研究已知和潛在的新型生物標志物。

06

軟件

軟件與儀器本身同樣重要，是成功鑒定化合物的基石之一。質(zhì)譜硬件當下處于非常先進的階段，結構解析的最終成功在于如何深度利用數(shù)據(jù)。這就要求開發(fā)更好的軟件程序，以及評估HRAM MS數(shù)據(jù)的復雜工具。

GC-Orbitrap/MS配套賽默飛專業(yè)的數(shù)據(jù)解卷積、大隊列的組學分析、和化合物質(zhì)譜裂解軟件。

組學分析軟件Compound Discoverer內(nèi)置高效靶向和非靶向分析工作流，幫助用戶最大化從代謝組學樣本中獲得的代謝覆蓋率和未知物質(zhì)注釋方面的信息，并可進行分子網(wǎng)絡、代謝通路分析。

質(zhì)譜裂解軟件Mass Frontier包含3萬多個裂解方案，其中包含十余萬個反應和相關結構?？梢詧?zhí)行直接分子搜索、子結構搜索、相似性搜索和名稱搜索，并且所有關聯(lián)的元數(shù)據(jù)都可以電子方式搜索，可用于開發(fā)計算機碎片預測。

Mass Frontier質(zhì)譜裂解軟件一瞥（從手繪到電子檢索預測）（點擊查看大圖）

總結

在代謝組學領域，GC-Orbitrap/MS被積極用于捕獲各種生物學背景的揮發(fā)性、非極性和極性（衍生）小分子。短短幾年，大量研究工作使用 GC-Orbitrap/MS生成了令人興奮的高通量和高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，涵蓋基礎研究到應用研究領域。通過靶向和非靶向工作流程，GC-Orbitrap/MS有望提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)集，以應對各種研究挑戰(zhàn)。

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