實(shí)驗(yàn)人必須要知道的，18個(gè)測(cè)序常見(jiàn)問(wèn)題

1．為什么需要新鮮的菌液？

首先，新鮮的菌液易于培養(yǎng)，可以獲得更多的DNA，同時(shí)最大限度地保證菌種的純度。

2．如何提供菌液？

如果您提供新鮮菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以將培養(yǎng)好的4～5ml菌液沉淀下來(lái)，倒去上清以方便郵寄。同時(shí)郵寄時(shí)最好用盒子以免郵寄過(guò)程中壓破。

3．如何制作穿刺菌？

用滅菌過(guò)1.5ml或2ml離心管加入LB瓊脂(7g/L)斜面凝固，用接種針挑取分散良好的單菌落穿過(guò)瓊脂直達(dá)管底，不完quan蓋緊管蓋適當(dāng)溫度培養(yǎng)過(guò)夜，然后蓋緊蓋子加封口膜，室溫或4度保存。

4． PCR產(chǎn)物直接測(cè)序有什么要求？

（1) 擴(kuò)增產(chǎn)物必須特異性擴(kuò)增，條帶單一。如果擴(kuò)增產(chǎn)物中存在非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，一般難以得到好的測(cè)序結(jié)果；

(2）必須進(jìn)行膠回收純化；

(3）DNA純度在1.6—2.0之間，濃度50ng/ul以上。

5．為什么PCR產(chǎn)物直接測(cè)序必須進(jìn)行Agarose膠純化？

如果不進(jìn)行膠純化而直接用試劑盒回收，經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致測(cè)序出現(xiàn)雙峰甚至亂峰，這主要是非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物或者原來(lái)的PCR引物去除不干凈所導(dǎo)致。

大多所謂的PCR“純化試劑盒”實(shí)際上只是回收產(chǎn)物而不能起到純化的作用的。對(duì)于非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物肯定無(wú)法去除，而且通常他們不能夠完quan去除所有的PCR引物，這會(huì)造成殘留的引物在測(cè)序反應(yīng)過(guò)程中參與反應(yīng)而導(dǎo)致亂峰。

6．如何進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化？

PCR產(chǎn)物首先必須用Agarose膠電泳，將特異擴(kuò)增的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒回收，產(chǎn)物用ddH2O溶解。

7． PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的好處？

（1) PCR產(chǎn)物直接測(cè)序可以反映模板的真實(shí)情況；

（2) 省去克隆的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用和時(shí)間；

（3) PCR產(chǎn)物測(cè)序正確的片段進(jìn)行下一步克隆實(shí)驗(yàn)使結(jié)果更有保障；

（4) 混合模板進(jìn)行PCR的產(chǎn)物直接測(cè)序可以發(fā)現(xiàn)其中的點(diǎn)突變。

8．對(duì)用于測(cè)序的質(zhì)粒DNA的要求有哪些？

對(duì)測(cè)序模板DNA的一般要求：

（1)DNA純度要求高，1.6—2.0之間，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)等；

（2)溶于ddH2O中，溶液不能含雜質(zhì)，如鹽類，或EDTA等螯合劑，將干擾測(cè)序反應(yīng)正常進(jìn)行。

9．如何鑒定質(zhì)粒DNA濃度和純度？

我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB(電泳緩沖液中不必加EB)，加一個(gè)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品。電泳結(jié)束以后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準(zhǔn)確地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質(zhì)粒DNA的不同構(gòu)型。

質(zhì)粒DNA的3種構(gòu)型是指在抽提質(zhì)粒DNA過(guò)程中，由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒(SC)的一條鏈斷裂，變成開(kāi)環(huán)狀(OC)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成為線狀(L)分子。

這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋型(SC)遷移速度最快，其次為線狀(L)分子，最慢為開(kāi)環(huán)狀(OC)分子。

使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，或者用溴乙錠-標(biāo)準(zhǔn)濃度DNA比較法只能檢測(cè)抽提到的產(chǎn)物中的濃度，甚至由于抽提的質(zhì)粒DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)、染色體DNA等因素的干擾，濃度檢測(cè)的數(shù)值也是沒(méi)有多少意義的。

10．為什么抽提的質(zhì)粒最好溶解在ddH2O中？

全自動(dòng)熒光測(cè)序由于反應(yīng)體系小，所以對(duì)于模板DNA的質(zhì)量要求比手工測(cè)序高許多。通常的提取質(zhì)粒的試劑盒會(huì)提供一個(gè)Elution Buffer給用戶洗脫DNA，我們建議用戶不要使用。因?yàn)槠渲泻械娜鏓DTA等組分會(huì)對(duì)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生干擾，甚至導(dǎo)致測(cè)序反應(yīng)失敗。

11．對(duì)測(cè)序引物的要求有哪些？

對(duì)測(cè)序引物的一般要求：

(1)特異性與測(cè)序模板結(jié)合，不能有多于4個(gè)堿基以上的錯(cuò)配現(xiàn)象；

(2)不能含有混合堿基；

(3)長(zhǎng)度17-25堿堿；

(4)純度高，最好PAGE純化；

(5)用ddH2O溶解，不要用TE溶解。

12．為什么測(cè)序引物必須特異地與DNA模板結(jié)合？

測(cè)序引物與待測(cè)樣品DNA分子只能有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是測(cè)序成功的前提。如果測(cè)序引物在DNA模板分子上有不只一個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)，將造成測(cè)序反應(yīng)過(guò)程中引物鏈在幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)處同時(shí)擴(kuò)增，從而得到鏈長(zhǎng)相同而組成不相同的終止鏈，測(cè)序電泳時(shí)收集到重疊峰或亂峰，無(wú)法讀取序列

13．為什么測(cè)序引物3'端以后有30-50堿基無(wú)法讀到？

全自動(dòng)熒光測(cè)序方法由于使用標(biāo)記了大熒光染料的ddNTP，一些未反應(yīng)完的ddNTP底物會(huì)連同測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物一并被沉淀，在測(cè)序電泳時(shí)會(huì)干擾測(cè)序信號(hào)，導(dǎo)致這部分堿基無(wú)法讀清。

一般的我們會(huì)在分析結(jié)果時(shí)切掉這部分無(wú)意義的數(shù)據(jù)。通常這也是載體的序列。所以選取測(cè)序引物時(shí)要使引物3'端離開(kāi)要求測(cè)序的起始位置50bp以上比較合適。而對(duì)于PCR產(chǎn)物測(cè)序就不可避免使得測(cè)序引物區(qū)域附近無(wú)法讀到數(shù)據(jù)。

14.為什么在測(cè)序報(bào)告上找不到引物序列？

有如下幾種情況:

（1）找不到測(cè)序所用的引物序列。這是正常的，因?yàn)闊晒鉁y(cè)序方法采用的是熒光標(biāo)記了的ddNTP，自動(dòng)測(cè)序儀通過(guò)檢測(cè)ddNTP上的熒光來(lái)讀取序列。由于引物本身是不被標(biāo)記的，所以在測(cè)序結(jié)果中也是找不到的。

（2）找不到克隆片段的擴(kuò)增引物。原因可能是您在構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)所用的酶的酶切位點(diǎn)距離您的測(cè)序引物太近，由于熒光染料的干擾在序列開(kāi)始的部分判讀不清。

（3）還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的，這時(shí)可以找一下引物的互補(bǔ)序列。

（4）存在單引物擴(kuò)增，有一條引物的特異性不好，有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致只有一條引物參與擴(kuò)增。

15．什么是Primer Walking 測(cè)序？

大于片斷較大的樣品，雙向測(cè)序如果不能完quan拼接，我們還可以為用戶按照上一個(gè)測(cè)序結(jié)果在一定的位置左右設(shè)計(jì)引物繼續(xù)測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果拼接，即Primer Walking 測(cè)序。

16．超過(guò)6Kb的DNA片斷如何進(jìn)行測(cè)序？

超過(guò)6Kb的DNA片斷用Shot Gun 進(jìn)行測(cè)序準(zhǔn)確并且節(jié)省時(shí)間， Shot Gun方法如下：

（1）用物理方法打碎DNA；

（2）回收1～1.5Kb的片斷；

（3）用核酸酶切平端，連接入載體；

（4）按照一定比例進(jìn)行測(cè)序，保證每一個(gè)區(qū)段有3倍以上的數(shù)據(jù)；

（5）編輯所有測(cè)序數(shù)據(jù)；

（6）如果有缺少數(shù)據(jù)的區(qū)域，還需要補(bǔ)充測(cè)序。拼接成完整序列。

17.為什么測(cè)序結(jié)果完quan不是所需的序列？

出現(xiàn)這樣的情況只有兩種可能：

（1）我們給您的測(cè)序結(jié)果對(duì)應(yīng)的不是您的樣品；

（2）您的樣品插入部分與您預(yù)期的不一致。

這時(shí)需要雙方將樣品進(jìn)行驗(yàn)證（PCR和酶切鑒定）。

18.樣品送測(cè)序前已經(jīng)鑒定過(guò)了，有插入片段的，為什么測(cè)序結(jié)果是一個(gè)空質(zhì)粒？

測(cè)序是對(duì)樣品的最好驗(yàn)證.結(jié)果為空載，可能如下：

（1）可能在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生插入片段的丟失，由于這種情況的發(fā)生無(wú)法事先預(yù)期到；

（2）提供的克隆是假陽(yáng)性克隆。