實驗室細胞培養(yǎng)細胞計數(shù)的方法

在細胞培養(yǎng)中，細胞計數(shù)是一項基本功，對于剛剛進入實驗室開始做細胞實驗的我們來說，讓人頭疼的就是給細胞計數(shù)了，雖然比較簡單，但是經(jīng)常暈頭轉向、數(shù)到眼瞎，而且萬一一個不小心被其他人打斷了思路，分分鐘前功盡棄。
其實，之所以覺得數(shù)細胞如此辛苦，很大一部分原因是還沒有掌握細胞計數(shù)的正確操作，當儀器對細胞計數(shù)分類出現(xiàn)異常時，手工顯微鏡檢查就顯的尤為重要。下面給大家總結下細胞計數(shù)的詳細步驟的方法，供大家參考。

1，首先準備好細胞計數(shù)器(血球計數(shù)板)
使用70%乙醇將蓋玻片和細胞計數(shù)板清潔、晾干備用。
將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細胞計數(shù)器上。
(注：使用前須保證蓋玻片和計數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細胞充池及計數(shù)結果。)
2，制備細胞懸液
對于貼壁生長的細胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落。(懸浮細胞則無需消化，稀釋到合適倍數(shù)即可。)
然后加入適當?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細胞，以得到均質的細胞懸液。要求盡可能將細胞吹散，不要殘留任何細胞團，但不可用力過大。
(注：消化太過或消化不全均會使計數(shù)結果產(chǎn)生偏差。)
臺盼蘭染色(可選)：
如果需要計算細胞的活率，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合;
室溫孵育3-5分鐘(懸浮細胞染色時間可視情況適當延長)，使臺盼蘭進入死細胞，使死細胞著藍色。
3，血細胞計數(shù)器加樣
使用吸管或移液器將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到計數(shù)池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數(shù)池，此即為充池。
(注：若需進行多個樣品的計數(shù)，應盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。)
以同樣的方式在另一側的計數(shù)池中也加入計數(shù)樣品。
將計數(shù)板靜置幾分鐘使細胞擴散、沉降。
4，細胞計數(shù)
在100倍顯微鏡下，移動計數(shù)板將視野對準計數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個視野(下圖標記的3號位置)。

分別計數(shù)大方格1.2.4.5中的細胞數(shù)。(為降低計數(shù)誤差，最好將細胞濃度調整為20-50個/大方格。)并重復記錄另一側計數(shù)池中的細胞數(shù)，總計8個大方塊，然后取均值。
計數(shù)原則為：“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。(判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線，如下圖所示)

如果有多個細胞沒有吹散而成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數(shù)細胞為單個細胞。
5，細胞濃度

由上圖可以得出，每個大方格的容積為：
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每個大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細胞數(shù)時需乘以104。
在常規(guī)沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細胞的個數(shù)：
每毫升樣品中細胞的個數(shù) = 每個大方格內細胞的平均數(shù) × 細胞稀釋倍數(shù)×104
如果使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細胞的百分率：
活細胞百分率(%)= 臺盼蘭拒染細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100
此時活細胞數(shù)的計算公式為：
每毫升樣品中活細胞的個數(shù) = 每個大方格中細胞的平均數(shù)×活細胞比率×細胞稀釋倍數(shù)×2×104
注：乘2是由于在臺盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當于稀釋了一倍。
看了以上步驟和原理，大家不禁會問：我們?yōu)槭裁匆獢?shù)細胞啊?細胞計數(shù)究竟有什么意義呢?其實，當我們想了解細胞的生長情況時，除了直接觀察細胞形態(tài)以外，繪制細胞生長曲線、計算細胞倍增時間應該就是廣泛采用的評價指標了。
所以盡管使用血細胞計數(shù)板手工計數(shù)細胞過程十分繁瑣，對實驗者操作者的要求也比較嚴格，現(xiàn)在也已有很多自動化的細胞計數(shù)器/儀，但對于科學研究中遇到的各種細胞而言，手工計數(shù)仍然是簡便易行的方法而被廣大實驗室采用。
 
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