qubit4熒光計(jì)蛋白濃度測(cè)定原理

qubit可以用于蛋白濃度測(cè)定
常用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
以下引用：

6種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
一、微量凱氏（kjeldahl）定氮法
樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：
nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)
2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)
(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)  
反應(yīng)（1）、(2)在凱氏瓶?jī)?nèi)完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。
為了加速消化，可以加入cuso4作催化劑，k2so4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。
計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得 樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白
氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、雙縮脲法（biuret法）
（一）實(shí)驗(yàn)原理
雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與cuso4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。
紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。
此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。
（二）試劑與器材
1. 試劑：
（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來(lái)校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用h2o 或0.9%nacl配制，酪蛋白用0．05n naoh配制。
（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso4•5h2o）和6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6•4h2o），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% naoh溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。
2. 器材：
可見(jiàn)光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。
（三）操作方法
1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20～25℃）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、樣品的測(cè)定：取2～3個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過(guò)10mg/ml。