快速高爾基染色試劑盒（神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞）操作使用說明

快速高爾基染色試劑盒（神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1808

產(chǎn)品規(guī)格：6×125ml

產(chǎn)品簡介：

Golgi-Cox浸染法是研究神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞正常和非正常形態(tài)有效的方法之一。 使用Golgi技術(shù)，在藥物處理過的動(dòng)物腦中和因神經(jīng)疾病死亡的病人腦中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)樹突和樹突微小的形態(tài)改變。然而Golgi染色法的不可靠性且費(fèi)時(shí)已成為這種方法廣泛應(yīng)用的障礙。

快速高爾基染色試劑盒（神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞）是根據(jù)Ramón-Moliner，Glaser和Van der Loos所闡述的方法原理設(shè)計(jì)的。該試劑盒不僅極大地改進(jìn)并簡化了Golgi-Cox技術(shù)，而且被證實(shí)在顯示神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，尤其是樹突棘的形態(tài)細(xì)節(jié)極為靈敏可靠。尚寶生物生產(chǎn)的快速高爾基染色試劑盒已被廣泛用于數(shù)種動(dòng)物腦組織染色。

產(chǎn)品組成：

需要但未包括在試劑盒里的物品

1. 雙蒸水或Milli-Q水

2. 塑料/玻璃管或瓶 、琉璃樣品回收器、天然毛畫筆、滴瓶、塑料鑷子

3. 組織學(xué)耗材：

明膠包被的顯微鏡載玻片

蓋玻片

染色罐

乙醇

二甲苯

樹膠封片劑

光學(xué)顯微鏡

組織制備

使用此試劑盒前必須仔細(xì)閱讀以下說明?。?/span> l

l 所用容器（最好為塑料材質(zhì)）必須用蒸餾水沖洗干凈。 l

l 當(dāng)溶液A和溶液B存在時(shí)不能使用金屬器具。 l

l 保持容器密封。 l

l 用溶液A和溶液B處理的組織和切片，應(yīng)該避光。 l

l 除非特別指出，以下流程需在室溫下完成。

1. 殺死動(dòng)物之前對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉。應(yīng)盡快地從顱骨中取出動(dòng)物的腦（或si去病人的腦），但操作時(shí)必須非常小心以免損傷或壓迫組織。

注意 l

l 除非必要，不要對動(dòng)物進(jìn)行灌注。如果確實(shí)需要對動(dòng)物進(jìn)行灌注（用4%的多聚甲醛處理不要超過5分鐘），一定不要對組織進(jìn)行后固定處理。 l

l 體積較大的腦部樣本包括大鼠腦部應(yīng)該用鋒利的刀片切成大約10mm厚的塊狀。重要提示！

2. 用雙蒸水或Milli-Q水快速?zèng)_掉組織表面的血液。

3. 把組織浸泡在由溶液A和B等體積混合的浸漬液中，室溫下黑暗保存兩周*。浸泡6個(gè)小時(shí)以后或次日更換新的浸漬液。

*對于大多數(shù)情況浸泡2周是足夠的。然而，不同的組織類型及組織的大小不同可能需要延長或縮短浸泡時(shí)間來達(dá)到最佳效果。對于每種類型的組織的浸泡時(shí)間應(yīng)該通過試驗(yàn)獲得，但是對于大多數(shù)組織浸泡3周是足夠的。注意，延長浸泡時(shí)間可能增加染色背景。

注意 l 

l 溶液A和溶液B的混合液至少在用之前24小時(shí)配制，并不能攪拌。 l

l 采用以上方案則不會(huì)產(chǎn)生沉淀是關(guān)鍵的。 l

l 制備好的浸泡液在用之前室溫黑暗保存可長達(dá)一個(gè)月。 l

l 每m³待研究組織至少用5ml浸泡液。注意用較少的浸泡液可能降低染色的靈敏性和可靠性。 l

l 為取得最佳結(jié)果，在浸泡期間每周兩次對裝有組織的容器可輕輕地左右旋渦（一定不要晃動(dòng)！）幾秒鐘。

Warning

溶液A和B（含有HgCl?，重鉻酸鉀和鉻酸鉀）接觸皮膚是有毒的，如果吞咽可能是致命的。實(shí)驗(yàn)應(yīng)該在化學(xué)通風(fēng)櫥中完成。當(dāng)操作這些試劑時(shí)應(yīng)穿戴防護(hù)服，手套和防護(hù)面具/眼鏡。不要把溶液A和B的廢棄物倒進(jìn)水槽中！ 

把溶液A和B的廢棄物收集起來放到一個(gè)瓶子中，致電安全辦公室或有執(zhí)照的專業(yè)廢物處理服務(wù)的部門處理些材料。

4. 轉(zhuǎn)移組織到溶液C中室溫黑暗至少72小時(shí)（可長達(dá)1周）。24小時(shí)后或次日至少更換一次溶液。

5. 在-20℃到-22℃的條件下用冷凍切片機(jī)將組織切成100-200um厚的薄片，也可用其它型號(hào)的顯微鏡薄片切片機(jī)包括滑動(dòng)切片機(jī)和振動(dòng)切片機(jī)。用樣本回收器把樣本轉(zhuǎn)移到含有溶液C的明膠包被的顯微鏡載玻片上。載玻片上多余的溶液用吸管吸走并用濾紙吸干（載玻片上的溶液必須盡可能地吸干否則切片將從載玻片上脫落下來）。切片可以室溫下自然風(fēng)干（不能用電風(fēng)扇或電熱板使其干燥）。為取得最佳結(jié)果，應(yīng)盡快地完成切片，制備好的切片如果保存于載玻片盒中，室溫黑暗條件下最長可保存3天。

注意 l

l 為避免組織受冷凍切片機(jī)的損害，并盡可能地保持細(xì)胞形態(tài)學(xué)，組織在進(jìn)行冷凍切片之前應(yīng)快速冰凍。比如，組織應(yīng)按以下描述盡可能地快速冰凍：把組織放在一個(gè)塑料匙中慢慢地浸入含有干冰的異戊烷中預(yù)冷（為取得最佳結(jié)果，溫度應(yīng)保持在-70℃以下并且浸入過程用時(shí)1分鐘，越慢越好）。組織完quan浸入異戊烷之后，使組織在異戊烷中浸幾秒鐘，然后再放置干冰上1分鐘以確保組織能很好地冰凍。進(jìn)行切片之前不要讓組織融化。 l

l 切片機(jī)的型號(hào)可能會(huì)有不同，但所用的型號(hào)確保能切厚的切片（比如100um）。 l

l 如果冰凍切片機(jī)只有一個(gè)溫度設(shè)置，那么在進(jìn)行切片之前把溫度設(shè)置在-22℃至少4個(gè)小時(shí)。如果有兩個(gè)溫度設(shè)置，那么設(shè)置槽內(nèi)溫度比樣本溫度低1℃。請注意大多數(shù)情況下-22℃是最佳的溫度，然而，為了更順利地切出切片并沒有破碎，不同型號(hào)的切片機(jī)和不同的組織可能需要更高或更低的槽內(nèi)溫度。 l

l 對于用冰凍切片機(jī)切片，以下幾點(diǎn)提示是有益的：1）用蒸餾水把組織固定于樣本盤上，但必須確保組織沒有融化（可以在干冰上完成）。組織可以被固定在任何類型的組織冰凍介質(zhì)上包括OCT，但要避免切斷介質(zhì)。不要在OCT中包埋組織，如果組織確實(shí)需要包埋，用TFM替代OCT。2）組織固定到樣本盤后，放置組織于干冰上10分鐘，然后立即把固定有樣本的樣本盤安裝到冰凍切片機(jī)上，等5分鐘之后進(jìn)行切片。3）切好的一些切片（不要使用防卷板），如果組織溫度過低比如切片顯示出與刀片平行的裂縫，先等幾分鐘再進(jìn)行下一個(gè)切片，否則可繼續(xù)切。 l

l 浸泡的腦可用瓊脂糖或明膠包埋然后用冰凍切片機(jī)切片。然而收集切片時(shí)（充滿切片槽），必須使用溶液C。否則切片易干燥裂紋。 l

l 如果用滑動(dòng)切片機(jī)切浸泡的組織，樣本盤和刀片都需維持在較低的溫度（0℃以下）按照操作手冊的描述切片固定在含有溶液C的載玻片上是重要的。

VI. 染色步驟 

在染色過程中和蓋蓋玻片之前的任何一步都不要讓切片變干

1. 用雙蒸水或Milli-Q水沖洗切片兩次，每次4分鐘。

2. 把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的雙蒸水或Milli-Q水組成的混合液中10分鐘。

比如：溶液D    10ml

溶液E    10ml

雙蒸水   20ml

注意 l

l 工作液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，每100ml工作液最多用于100張切片（比如小鼠腦）， 根據(jù)切片的大小。 l

l 盛有工作液的瓶子或染色罐必須蓋好蓋子防止試劑蒸發(fā)。 l

l 為取得最佳結(jié)果，孵育期間應(yīng)頻繁攪拌工作液。

3. 用蒸餾水或Milli-Q水沖洗切片兩次，每次4分鐘（蒸餾水應(yīng)頻繁更換新的）。

4. 用結(jié)晶紫或硫堇對切片進(jìn)行復(fù)染（可選步驟）。

注意 l

l 對于復(fù)染，延長步驟3的時(shí)間，比如用沖洗4次每次5分鐘代替原來的沖洗2次每次4分鐘，或者更長的時(shí)間。

5. 在50%，75%和95%的乙醇中對切片進(jìn)行脫水，每個(gè)濃度梯度脫水4分鐘（不要跳過任何一個(gè)步驟）。

6. 然后在無水乙醇中對切片進(jìn)行脫水，4次，每次4分鐘（不要延長時(shí)間）。

7. 在二甲苯中透明，3次，每次4分鐘，并且用樹脂封片劑對蓋玻片進(jìn)行封片。

注意 l

l 蓋玻片之前切片可以暫時(shí)存于二甲苯中幾個(gè)小時(shí)。 l

l 為取得最佳結(jié)果，最好用未稀釋的封片劑。 l

l 用Golgi染色的切片無論何時(shí)都應(yīng)避光保存。

注意事項(xiàng)

1. 快速高爾基染色試劑盒（神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞）僅用于體外研究，不能用于診斷或其它應(yīng)用。

2. 試劑盒所包含有試劑是有毒的，吸入或接觸皮膚是有害的，如果吞咽可能是致命的。不要用嘴吸。避免吸入和接觸皮膚和眼睛。如果接觸，立即用大量的水沖洗并求助醫(yī)生。

3. 在化學(xué)通風(fēng)櫥下完成實(shí)驗(yàn)。操作這些試劑時(shí)須穿戴合適的防護(hù)服，手套和眼睛和面部防護(hù)罩，完成實(shí)驗(yàn)之后把手沖洗干凈。