線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)的應(yīng)用及使用方法！

       線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)的應(yīng)用及使用方法！

一、背景

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)是利用JC-1探針檢測(cè)線粒體膜電位變化的試劑盒，可以快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

本試劑盒染料JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential）△Ψm的理想熒光探針。與其他的陽(yáng)離子染料如DiOC6(3)和羅丹明123相比，特異性更高，對(duì)線粒體膜電位變化的特異性高于質(zhì)膜電位變化，對(duì)線粒體去極化檢測(cè)的檢測(cè)一致性更好；紅綠色熒光強(qiáng)度比率只受線粒體膜電位的變化，不受線粒體大小，形狀，密度的差異干擾；檢測(cè)靈敏度強(qiáng)，對(duì)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的微小異質(zhì)性都能辨別。

JC-1有單體和聚合體兩種形式，兩者的發(fā)射光譜不同。JC-1單體(J-monomer)的激發(fā)波長(zhǎng)為514nm，發(fā)射波長(zhǎng)為529nm；JC-1聚合物(J-aggregates)的激發(fā)波長(zhǎng)為585nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。

JC-1可以透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，以單體狀態(tài)游離于胞質(zhì)內(nèi)，正常健康細(xì)胞的線粒體的膜電位較高，具有極性，JC-1依賴于膜電位的極性被迅速攝入線粒體的基質(zhì)內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，多聚體488nm激發(fā)時(shí)的發(fā)射波長(zhǎng)為590nm，發(fā)射光為橙紅色熒光，在流式圖上表現(xiàn)為FL1和FL2雙陽(yáng)性；當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，線粒體跨膜電位被去極化，線粒體膜電位較低，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，從線粒體內(nèi)釋放到細(xì)胞質(zhì)，此時(shí)JC-1為單體，488nm激發(fā)時(shí)發(fā)射波長(zhǎng)為527nm，可以產(chǎn)生綠色熒光，形成流式圖中細(xì)胞FL1為陽(yáng)性。凋亡細(xì)胞則大多為FL1單陽(yáng)性。

這樣就可以非常方便地通過(guò)熒光顏色的轉(zhuǎn)變來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體去極化的比例。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到細(xì)胞膜電位的下降，同時(shí)也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。

二、使用方法

1、收集樣本細(xì)胞以及陰性、陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量在2-5X105個(gè)。

2、用PBS洗滌細(xì)胞兩次。離心收集細(xì)胞。

3、用500ul JC-1染色工作液將細(xì)胞重懸，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15-30分鐘。

4、在4°C，300-500×g力離心間5分鐘，棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞。

5、用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。

6、用500ul PBS將細(xì)胞重懸。

7、用流式細(xì)胞儀或熒光分光光度計(jì)檢測(cè)分析結(jié)果，或者用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

三、應(yīng)用

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)可以用于精子線粒體膜電位檢測(cè)在評(píng)估男性生育力中的作用研究：

探索育齡男性精子線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)與精液質(zhì)量、血清性激素、促性腺激素的關(guān)系及其在評(píng)估男性生育力中的作用。

方法：募集2017年6月-2020年11月至就診的男性志愿者及其配偶共90例,收集基本資料,進(jìn)行精液常規(guī)分析,檢測(cè)精子MMP、精子頂體反應(yīng)率(acrosomal reaction,AR)、血清性激素(T、E2)、促性腺激素(LH、FSH、PRL)、生育力指數(shù)(fertility index,FI)。分析募集者精子MMP與上述其他各指標(biāo)之間的關(guān)系;計(jì)算本組募集者精子MMP截?cái)嘀挡⒏鶕?jù)截?cái)嘀捣譃楦呔覯MP組和低精子MMP組,同時(shí)分析比較兩組在本研究觀察期內(nèi)募集者配偶的懷孕率;根據(jù)精子濃度、精子前向運(yùn)動(dòng)率(progressive motility,PR)及正常形態(tài)率是否低于參考下限值,將男性志愿者分為正常組和異常組,分析上述各指標(biāo)的組間差異。

結(jié)果：(1)異常組與正常組一般特征及精液參數(shù)對(duì)比:一般特征具有可比性,兩組男性志愿者配偶隨訪期內(nèi)懷孕人數(shù)和兩組既往配偶有生育史人數(shù)無(wú)顯著性差異(p>0.05);精液量、p H、畸形精子指數(shù)(the teratozoospermia index,TZI)、精子尾部缺陷率、血清性激素及促性腺激素、精子AR無(wú)顯著性差異(p>0.05)。異常組精子畸形指數(shù)(the sperm deformity index,SDI)、精子頭部及頸部缺陷率較正常組高(p<0.05),精子MMP和FI較正常組明顯降低(p<0.05)。

(2)精子MMP與各指標(biāo)相關(guān)分析:精子MMP與FSH(r=-0.258,p<0.05)及精子頭部畸形率(r=-0.254,p<0.05)呈負(fù)相關(guān),與精子濃度(r=0.285,p<0.05)、精子正常形態(tài)率(r=0.319,p<0.05)、精子PR(r=0.504,p<0.05)、精子總活力(PR+NP(non-progressivity motility,NP))(r=0.463,p<0.05)、FI(r=0.443,p<0.05)呈正相關(guān)。與年齡、血清激素、LH、PRL、SDI、TZI及精子AR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(p>0.05)。

(3)精子MMP對(duì)精子質(zhì)量正常與否的ROC曲線分析:精子MMP曲線下面積(AUC)為0.814(p<0.05,95%CI:0.725-0.903),Cut-off值為0.507,敏感性0.73,特異性0.87。

(4)高精子MMP組和低精子MMP組募集者配偶懷孕率的對(duì)比:精子MMP>50.7%組男性志愿者配偶隨訪期內(nèi)懷孕人數(shù)明顯高于精子MMP≤50.7%組(χ2=5.035,p=0.025),兩組既往配偶有生育史人數(shù)無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

結(jié)論：精子MMP是反應(yīng)精子功能、精確評(píng)價(jià)精子質(zhì)量及男性生育力的潛在指標(biāo),提示臨床中在精子常規(guī)參數(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合精子MMP能更精確全面地評(píng)價(jià)育齡男性的生育力。

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