1. 方法驗(yàn)證
分析方法驗(yàn)證是證明分析程序適合其預(yù)期目的的過(guò)程5。并非所有驗(yàn)證特征都適用于粒度分析。較早的 FDA 工業(yè)指南(非實(shí)施)草案文7包括一個(gè)專門針對(duì)粒度分析的部分。盡管較新的已發(fā)布文件取代了較舊的指南草案,但有關(guān)粒度分析的較舊部分提供了有關(guān)粒度分析與其他技術(shù)(如 HPLC)的不同之處的見解。舊文檔中的以下聲明有助于方法驗(yàn)證工作:
“方法驗(yàn)證通常涉及中間精度和重復(fù)性的評(píng)估。應(yīng)保證生成的數(shù)據(jù)是可重復(fù)的,并控制產(chǎn)品的質(zhì)量?!?sup>7
考慮到這一評(píng)論,下面提供了解決 DLS 方法驗(yàn)證的建議:
● 特異性:N/A,DLS 檢測(cè)大小變化但對(duì)不同化學(xué)物質(zhì)不敏感。
● 線性:N/A,DLS 沒(méi)有任何線性關(guān)系。
● 準(zhǔn)確性:N/A,儀器的準(zhǔn)確性使用標(biāo)準(zhǔn)粒子進(jìn)行驗(yàn)證,但常規(guī)定量裁判方法(SEM/TEM 顯微鏡)不包括準(zhǔn)確性確定。包括樣品的 SEM/TEM 圖像以支持方法驗(yàn)證可能是更合適的。
● 精密度(重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性):這是需要重點(diǎn)關(guān)注的地方。通常這些術(shù)語(yǔ)的定義在粒度分析領(lǐng)域可能不同于其他技術(shù)。以下評(píng)論來(lái)自粒度分析領(lǐng)域:
重復(fù)性:多次測(cè)量樣品。
重現(xiàn)性:準(zhǔn)備樣品、測(cè)量、丟棄、清潔、重復(fù)。建議的方法是制備五份樣品,然后對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行五次分析。
中間精密度:此活動(dòng)涉及第二位分析員、第二臺(tái)儀器或兩者兼而有之。如果所有測(cè)試都在一個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行,則由同一系統(tǒng)上的不同操作員在不同日期分析同一批次的樣品。如果要在多個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試,則同一樣本(或批次)由不同操作員在不同地點(diǎn)的不同系統(tǒng)上進(jìn)行分析。
● 范圍:N/A,僅在所用系統(tǒng)的工作范圍內(nèi)工作。無(wú)需對(duì)此進(jìn)行測(cè)試或記錄。
● 定量限:N/A,這只是測(cè)試粒徑。
● 檢測(cè)限:N/A,方法開發(fā)應(yīng)確保樣品在系統(tǒng)檢測(cè)限內(nèi)。
2. 結(jié)構(gòu)示例
兩名操作員在兩個(gè) Nicomp DLS 系統(tǒng)上分析了一種藥物物質(zhì)(異丙酚乳劑)。該樣品已過(guò)期,但仍顯示符合 USP<729>的合格結(jié)果。儀器設(shè)置如下:
Instrument A:
Instrument type | Nicomp 3000 |
Age | 5 years old |
Laser power | 35 mW |
Detector | PMT |
Detector angle | 90° |
Software version | ZPW388 V2.17.0215 |
Instrument B:
Instrument type | Nicomp 3000 |
Age | new |
Laser power | 35 mW |
Detector | PMT |
Detector angle | 90° |
Software version | ZPW388 V2.17.0215 |
3. 方法開發(fā)
首先分析 92 nm PSL 標(biāo)準(zhǔn)以確保適當(dāng)?shù)南到y(tǒng)性能。測(cè)量結(jié)果在預(yù)期值的 98% 以內(nèi)。建議在開始此類工作之前進(jìn)行此驗(yàn)證測(cè)試。
接下來(lái)進(jìn)行快速研究以測(cè)試濃度(稀釋)的影響。參見圖 1 中的結(jié)果。
遵循這些指南的內(nèi)容,DLS 規(guī)格(根據(jù)定義尺寸小于 10 µm)對(duì)于強(qiáng)度平均值可以是可重復(fù)的 ±20%,對(duì)于 PI 或其他計(jì)算結(jié)果指示分布寬度是可重復(fù)的 ±30%。對(duì)于某些藥品,這可能是一個(gè)可以接受的范圍,但要注意當(dāng)粒徑非常小時(shí)出現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)問(wèn)題。如果平均粒徑為 500 nm,±20%,則范圍為 400 – 600 nm,這還不錯(cuò)。但對(duì)于平均粒徑為 10 nm 的蛋白質(zhì),范圍則為 8-12 nm,這樣的粒徑跨度變得非常挑戰(zhàn)且難以接受。
將 10 滴樣品加入 15 mL 去離子水中并進(jìn)行分析。重復(fù)相同的制備。然后將這些樣品按 2:1 稀釋并進(jìn)行分析。樣品看起來(lái)太渾濁,結(jié)果發(fā)生變化,因此將下一滴添加到 15 mL DI 水中。樣品出現(xiàn)輕微混濁,這些結(jié)果是可以接受的。有時(shí),稀鹽溶液是比純?nèi)ルx子水更好的稀釋劑。下一步是將一滴樣品加入 10 mL 過(guò)濾后的 10 mM KCl 溶液中。這些結(jié)果似乎更好,因此 10 mM KCl 溶液用于本研究中的所有其他測(cè)量。
在進(jìn)行稀釋研究時(shí),分析時(shí)間也從3分鐘到10分鐘不等。三分鐘、五分鐘和十分鐘分析時(shí)間的時(shí)間曲線圖如圖2-4所示。紅色=光強(qiáng)粒徑平均值,藍(lán)色=體積粒徑平均值,藍(lán)色=數(shù)量粒徑平均值。
該方法選擇了5分鐘的分析時(shí)間。在五分鐘的分析時(shí)間完成之前,光強(qiáng)平均粒徑結(jié)果已經(jīng)穩(wěn)定下來(lái)。但直到大約9分鐘前,體積和數(shù)量加權(quán)平均結(jié)果仍在變化。這是也是在使用DLS時(shí)僅選擇光強(qiáng)粒徑結(jié)果的一個(gè)原因。這可能是方法開發(fā)中測(cè)試重復(fù)性很好的一個(gè)點(diǎn)。在這種情況下,也許下一個(gè)測(cè)試的分析時(shí)間是四分半、五分和五分半鐘。在這項(xiàng)研究中沒(méi)有執(zhí)行這一步驟,值得指出的是,整個(gè)方法開發(fā)和驗(yàn)證研究在不到8個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。更嚴(yán)格的最終發(fā)布測(cè)試方法開發(fā)和驗(yàn)證方法很可能需要至少幾天時(shí)間。
4. 樣品準(zhǔn)備
——在干凈的瓶子里裝滿10毫升過(guò)濾后的KCl溶液
——用針頭注射器取出0.5毫升異丙酚
——在瓶子里注入1滴異丙酚和10毫升KCl溶液
——手旋轉(zhuǎn)直到混合(10秒)
——用一次性移液管將400μL樣品移入圓形一次性玻璃樣品池
——將玻璃樣品池放入黑色Holder支架·在Nicomp上打開樣品蓋
——將樣品池和支架插入Nicomp系統(tǒng),Holder支架背向Nicomp的左側(cè)
——關(guān)閉Nicomp上的樣品蓋
確保儀器設(shè)置與如下所示的值匹配:
Temp | 23℃ |
Viscosity | 0.933 cP |
Liquid index of refraction | 1.333 |
Intensity setpoint | 300 KHz |
First channel usd | 2 |
External fiber angle | 90° |
Scattering angle | 90° |
Print molecular weight | unchecked |
Autoset channel width | checked |
Autoset sensitivity | checked |
Auto nicomp parameter | checked |
Auto baseline adjust | checked |
Cum % set point | 10% |
Autodilution ND position | N/A |
Number of print/save cycles | 5 |
Using run time | 5 minutes |
Using fit error | unchecked |
Clear autocorrelator | unchecked |
Print result | unchecked |
Automatic choice of distribution | unchecked |
Store data on disk | checked |
Overwrite old file | unchecked |
Save data log | checked |
——單擊綠色“G”圖標(biāo)開始測(cè)量
——打印并記錄平均直徑、標(biāo)準(zhǔn)偏差、PI 、D10、D50 和 D90
——將結(jié)果輸入 Excel 電子表格
——計(jì)算五項(xiàng)分析的平均值和變異系數(shù)
——比較兩個(gè)數(shù)據(jù)集
5. 結(jié)果
樣品在 A 和 B 系統(tǒng)上獨(dú)立制備和分析。每個(gè)樣品分析五次以檢查重復(fù)性。這兩個(gè)系統(tǒng)的示例結(jié)果如圖 5 和圖 6 所示。
整個(gè)結(jié)果以表格形式顯示在圖 7 和圖 8 中。五個(gè)結(jié)果的疊加如圖所示。
6. 結(jié)論
查看綜合結(jié)果可以得出以下幾點(diǎn)觀察結(jié)果:
——即使是相隔數(shù)年生產(chǎn)的兩個(gè)系統(tǒng)也會(huì)生成相似的數(shù)據(jù)
——兩個(gè)系統(tǒng)之間存在明顯的 3% 偏差
——PI計(jì)算可能不是用于定義寬度分布的最佳值
——如果使用PI,則30%的差值似乎是合適的
——D10、D50、D90 結(jié)果顯示出更好的重現(xiàn)性,可能更容易為制藥行業(yè)所接受
純粹基于該數(shù)據(jù)集,基于三個(gè)測(cè)量的該藥物產(chǎn)品的規(guī)格可能類似于:
——光強(qiáng)平均值 = 200 nm ±20%,COV = 小于 20%
——D10 = 140 nm ±30%,COV = 小于30%
——D90 = 284 nm ±30%,COV = 小于 30% 或
——PI = 0.09 ±30%
上述建議規(guī)格僅來(lái)自觀察到的重現(xiàn)性,可能對(duì)藥物安全性或有效性沒(méi)有任何影響。USP<729>中的實(shí)際是否通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的要求只是粒徑尺寸必須低于 500 nm 并且具有低x2值。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的另一種方法可能是關(guān)注影響有效性和/或安全性的粒徑大小。本技術(shù)說(shuō)明收集的數(shù)據(jù)是讓您了解 DLS 技術(shù)對(duì)于簡(jiǎn)單樣品的可重復(fù)性/重現(xiàn)性
7. 儀器介紹
參考資料
1 USP<729>, Globule Size Distribution in Lipid Injectable Emulsions
2 ISO 22412 Particle size analysis — Dynamic light scattering (DLS)
3 USP<429>, Light Diffraction Measurement of Particle Size
4 Entegris Technical Note, DLS Sample Preparation
5 Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics, July 2015
6 Entegris Technical Note, DLS System Verification
7 Guidance for Industry, Analytical Procedures and Methods Validation, Draft Guidance, July 2000. No longer available for download at FDA website.
8 Entegris Technical Note, DLS Data Interpretation
相關(guān)產(chǎn)品
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