過氧化氫酶測定步驟

過氧化氫酶

測定步驟：
（1）SOD提取：
稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎細(xì)胞，加入15mL的PH7.8 0.05mol/L的磷酸緩沖液，研磨攪拌20分鐘，使SOD充分溶解，6000rpm離心，棄去沉淀，得上清液。（留出1mL備用，準(zhǔn)確量取剩余上清液體積，記錄）
（2）除雜蛋白：
提取液加入1/4體積的氯仿-乙醇混合液攪拌10min，6000rpm離心15min去沉淀，得粗酶液。（取1mL粗酶液備用,測量剩余粗酶液體積）
（3）SOD酶的沉淀分離：
剩余的粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000rpm離心15min，得到SOD酶沉淀。將沉淀先加2mL磷酸緩沖液，溶解后再加3mL混勻。6000rpm離心15min，取上清得到SOD酶液。取1mL備用，其余量取體積。
（4）粗酶液活性測定：
提取液、粗酶液、酶液中SOD活力檢測，具體步驟如下。
加入鄰苯三酚后迅速混勻，準(zhǔn)確計時4min，加一滴濃鹽酸停止反應(yīng)，420nm測吸光值。
試劑/（mL）
空白管
對照管OD1
提取液OD2
粗酶液OD2
酶液OD2
PH8.3緩沖液
3
3
3
3
3
SOD提取液
0
0
0.1
0.1
0.1
蒸餾水
2
1.8
1.7
1.7
1.7
室溫放置20min
鄰苯三酚
0
0.2
0.2
0.2
0.2
（5）溶液中可溶性蛋白含量測定：
分別從1mL備用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3mL按以下倍數(shù)稀釋，260nm/280nm測定吸光值，按公式計算蛋白質(zhì)濃度。
提取液稀釋：50 ×
粗酶液稀釋：20 ×
酶液稀釋：10 ×