1. 在無菌的0.5ml或0.2ml離心管中按下列操作程序加樣:
反應(yīng)物 加樣順序 體積(μl) 終濃度
去離子水 1 29.4
10×Buffer B 2 5 1×
4×dNTP混合物 3 5 各200μmol/L
MgCl2 4 3 1.5mmol/L
有義引物 5 2.6 0.25μmol/L
反義引物 6 2.6 0.25μmol/L
模板 7 2 0.1μg
TaqDNA聚合酶 8 0.4 1unit
2. 用微量可調(diào)加樣器和一次性Tip向每一管中加50μl礦物油。每加一管換一次Tip。
3. 振蕩每只管,然后短暫離心。
4. 將管放到預(yù)熱的熱循環(huán)中,按下列程序開始循環(huán):
預(yù)變性 94℃ 4分鐘 1次
變性 94℃ 1分鐘
退火 37-65℃ 1分鐘
延伸 72℃ 1分鐘
循環(huán)30次
終延伸 72℃ 7分鐘 1次
保存 4℃
5. 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,分析結(jié)果。電泳條件:60-80V,15-20分鐘。
6. 紫外分析儀檢查電泳結(jié)果。
四、討論
1.假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量,④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
模板:①模板中含有Taq酶抑制劑,②在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。③模板核酸變性不底。在酶和引物質(zhì)量好時,不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,有可能是模板核酸提取過程出了毛病,可使用陽性對照的DNA模板配合檢查模板質(zhì)量。
酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。
引物:引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為:①選定一個好的引物合成單位。
②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
反應(yīng)體積的改變:通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul、或100ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul
后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。
物理原因:變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率,退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計,檢測一下
擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
2.假陽性
出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。
引物設(shè)計不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增
時,擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:
①操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。
②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。
③必要時,在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。
3.出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有:
①必要時重新設(shè)計引物。
②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
4.出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量
差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:
①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。
②減少dNTP的濃度。
③適當(dāng)降低Mg2+濃度。
④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
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