α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性檢測試劑盒（可見分光光度法）使用說明

α-葡萄糖苷酶(α-GC)活性檢測試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號：BA1933

產(chǎn)品規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品簡介：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵 生成葡萄糖，不僅與細胞壁的松弛或加固有關(guān)，而且與細胞識別和一些信號分子產(chǎn)生密切相關(guān)。

α-GC分解對-硝基苯-α-D吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通過測定吸光值升高速 率來計算α-GC活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

產(chǎn)品組成：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取1瓶加10mL蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

2. 標準品：5μmol/mL的對硝基苯酚溶液。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲破碎儀、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 細菌或培養(yǎng)細胞的處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每1000萬細菌或細胞加入1mL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），15000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測。

2. 組織的處理：稱取約0.2g組織，加入1mL提取液進行冰浴勻漿；15000g，4℃，離心20min，取上清，置冰上待測。 液體樣本：直接檢測。若溶液有渾濁需離心后取上清進行測定。  

二、測定步驟

1. 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 標準溶液的稀釋：將 5μmol/mL的標準液用蒸餾水稀釋成100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL標準溶液待測。

3. 標準液稀釋可參考下表。

實驗中每個標準管需500µL標準溶液。

4. 加樣表：

三、α-GC活力計算

1. 標準曲線的建立：

根據(jù)標準管的濃度（x，nmol/mL）和吸光度（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA（y，ΔA測定）代入公式計算樣本產(chǎn)物濃度x（nmol/mL）。

2. α-GC活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GC活力（U/mg prot）=（x×V反總）÷（V樣×Cpr）÷T=20x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α-GC活力（U/g 質(zhì)量）=（x×V反總）÷（W×V樣÷V樣總）÷T=20x÷W。

（3）按細菌或細胞數(shù)量計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞在每mL體系中每小時產(chǎn)生1nmol對-硝基苯酚定義為一個酶活力單位。

α- GC活力（U/10⁴ cell）=（x×V反總）÷（1000×V樣÷V樣總）÷T=0.02x

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需要另外測定；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；1000：細胞或細菌總數(shù)，1000萬； T：反應(yīng)時間，0.5h。

注意事項：提取液中含有使蛋白變性的成分，故按蛋白濃度計算時需要重新提取蛋白進行測定。