細胞活性測定方法專題討論---金壇市精達儀器制造廠

我們在實驗過程中很多時候都要用到細胞活性測定技術，現(xiàn)在常用的細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素摻入法、MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

請您以自己實驗過程中的親身經歷對目前使用的細胞活性測定方法做一客觀評價，可以介紹自己對各種細胞活性測定方法的理解，每種方法的優(yōu)缺點，自己實驗過程中的小技巧，實驗中的經驗教訓，您所知的其它細胞活性測定方法等等。

網(wǎng)友[xiaoba_008]：

細胞活性測定方法介紹和使用探討：
細胞活性測定方法有臺盼藍染色法、克?。洌┬纬煞?、3H放射性同位素摻入法、MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用。但MTT法形成的Formazan為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由于在去上清操作時會有可能帶走小部分的Formazan，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發(fā)了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。

現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個簡單介紹：

1、MTT法
MTT：化學名： 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由于MTT經還原所產生的甲臜產物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲臜的有機溶劑對實驗者也有損害。

2、XTT法
XTT：化學名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲臜產物。當XTT與電子偶合劑（例如PMS）聯(lián)合應用時，其所產生的水溶性的甲臜產物的吸光度與活細胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優(yōu)于MTT。
缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、CCK-8法或稱WST-8法
CCK-8試劑中含有WST–8：化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazan）。生成的甲臜物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞，不需要放射性同位素和有機溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細胞密度；4、重復性優(yōu)于MTT；5、對細胞毒性?。?、為1瓶溶液，毋需預制，即開即用。

缺點：1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產生漏加或多加。