電轉(zhuǎn)效率低？你可能忽略了這些

最近，總有小伙伴們前來(lái)詢問(wèn)在做完電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染效率太低了該怎么辦，于是小優(yōu)通過(guò)搜集多方資料、詢問(wèn)技術(shù)專(zhuān)家，為大家找來(lái)了一些解決方案，下面我們就來(lái)一起看看吧～

一、什么是電轉(zhuǎn)？

俗話說(shuō)得好，知己知彼，方能百戰(zhàn)百勝，所以首先我們需要清楚電轉(zhuǎn)的原理。電轉(zhuǎn)，也稱(chēng)電穿孔法，是通過(guò)脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔，將外源分子（DNA、RNA 、mRNA等）導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)，來(lái)改變細(xì)胞的特性，從而達(dá)到改造細(xì)胞的目的，是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)研究的重要工具。與其他細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)相比，電轉(zhuǎn)具有操作簡(jiǎn)便、適用多種細(xì)胞、重復(fù)性好和轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。

二、影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些呢？

影響電轉(zhuǎn)效率的因素有很多，總結(jié)下來(lái)有三方面：電轉(zhuǎn)過(guò)程、細(xì)胞狀態(tài)以及轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)。只有了解影響電轉(zhuǎn)效率的因素有哪些，我們才能夠“對(duì)癥下藥”。

1.電轉(zhuǎn)過(guò)程

1）電轉(zhuǎn)的完整操作步驟包括電轉(zhuǎn)前操作，電轉(zhuǎn)執(zhí)行和電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)。在進(jìn)行電轉(zhuǎn)前操作時(shí)，電轉(zhuǎn)試劑、細(xì)胞與轉(zhuǎn)染底物要進(jìn)行混勻，如果混勻時(shí)過(guò)于激烈，會(huì)破壞轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低；

2）在進(jìn)行電轉(zhuǎn)前操作時(shí)，電擊緩沖液的選擇也很重要，由于細(xì)胞對(duì)緩沖液的離子組成和滲透壓非常敏感，因此組分與細(xì)胞質(zhì)類(lèi)似的緩沖液有利于細(xì)胞電擊后的存活；

3）電轉(zhuǎn)執(zhí)行時(shí)，需要控制電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間。適當(dāng)提高電場(chǎng)強(qiáng)度或延長(zhǎng)脈沖時(shí)間，能使底物更容易進(jìn)入細(xì)胞，但細(xì)胞的死亡率也會(huì)增加。一般電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置遵循低電場(chǎng)長(zhǎng)時(shí)程的原則。如果選擇內(nèi)置優(yōu)化程序的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，如Lonza的Nucleofector系統(tǒng)，則可以節(jié)省摸索電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的步驟。

4）轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中含有抗生素會(huì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，這是因?yàn)檗D(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有損傷，這時(shí)培養(yǎng)基中的抗生素會(huì)進(jìn)一步損傷細(xì)胞，因此我們建議使用不含抗生素的培養(yǎng)基或PBS；

5）電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)要注意，如果使用傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后4-6h后必須進(jìn)行換液，否則會(huì)由于轉(zhuǎn)染試劑毒性而引起細(xì)胞死亡，最終影響轉(zhuǎn)染效率。

2.細(xì)胞狀態(tài)

1）細(xì)胞污染對(duì)細(xì)胞狀態(tài)的影響很大，受到細(xì)菌、真菌或支原體污染的細(xì)胞都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低、細(xì)胞死亡率增加，尤其是支原體污染悄無(wú)聲息，因此一定要做好定期的支原體檢測(cè)，確保細(xì)胞狀態(tài)；

2）細(xì)胞培養(yǎng)到不同密度都能用于電轉(zhuǎn)，但好的轉(zhuǎn)化效率是在細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（15代以內(nèi)，傳代后2d）。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，有絲分裂較旺盛，表面結(jié)構(gòu)密度比穩(wěn)定期的細(xì)胞差，電轉(zhuǎn)后，細(xì)胞膜的恢復(fù)能力強(qiáng)，而且處于有絲分裂期的細(xì)胞更容易接受外源DNA。

3.轉(zhuǎn)染底物狀態(tài)

1）不同的轉(zhuǎn)染底物對(duì)轉(zhuǎn)染效率都會(huì)產(chǎn)生不同的影響，例如質(zhì)粒DNA在大小、用量以及構(gòu)象這三方面都影響著電轉(zhuǎn)效率，IRES導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低，轉(zhuǎn)染mRNA需要調(diào)整洗滌次數(shù)等等；

2）轉(zhuǎn)染試劑與底物的配比，也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，因此需要根據(jù)說(shuō)明書(shū)或參考文獻(xiàn)來(lái)進(jìn)行配比優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選用最佳配比濃度；

3）底物的內(nèi)毒素，也會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，內(nèi)毒素含量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染過(guò)程中細(xì)胞狀態(tài)變差，從而增加細(xì)胞死亡率，降低轉(zhuǎn)染效率，因此要對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行控制。

三、如何提高電轉(zhuǎn)效率？

我們都知道，電轉(zhuǎn)的操作是需要借助儀器來(lái)完成的，因此除了要考慮上面的這些因素外，更重要的是選擇一個(gè)高效的電轉(zhuǎn)儀。Nucleofector™技術(shù)是Lonza公司的zhuan利創(chuàng)新技術(shù)，利用電擊在細(xì)胞膜上開(kāi)個(gè)小孔，綜合各種特定細(xì)胞轉(zhuǎn)染程序與轉(zhuǎn)染液的作用，核酸底物不僅可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，還可直接通過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核。相較于傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)技術(shù)，Nucleofector™技術(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率可達(dá)99%，且實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染不依賴(lài)于細(xì)胞的分裂。

01 Nucleofector™技術(shù)核心：核電轉(zhuǎn)

利用特定的轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞保護(hù)劑，通過(guò)細(xì)微差別的電脈沖，使得轉(zhuǎn)染物質(zhì)不僅可以直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而且可以直接通過(guò)核膜進(jìn)入到細(xì)胞核。

注：圖片來(lái)自Lonza

02 Nucleofector™技術(shù)組成

1）Nucleofector™設(shè)備：內(nèi)置針對(duì)每種細(xì)胞優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染參數(shù)。

2）配套試劑盒：試劑盒是包含有轉(zhuǎn)染試劑，細(xì)胞保護(hù)劑，專(zhuān)用電極杯，吸管、pmaxGFP™陽(yáng)性質(zhì)粒。

3）數(shù)據(jù)庫(kù)與操作手冊(cè)：幾百種細(xì)胞的詳細(xì)的優(yōu)化方案，不僅有轉(zhuǎn)染步驟，也包含了核轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的處理，如細(xì)胞來(lái)源、傳代、生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)等細(xì)節(jié)技巧。

03 提高電轉(zhuǎn)效率的方法

1.細(xì)胞收集時(shí)：

1)在消化貼壁細(xì)胞時(shí)，一定要注意終止胰酶反應(yīng)，防止過(guò)度消化；最好使用專(zhuān)業(yè)的胰酶中和劑；

2)在進(jìn)行細(xì)胞離心時(shí)，使用低轉(zhuǎn)速長(zhǎng)時(shí)間離心，提升細(xì)胞的存活率；

3)選擇合適狀態(tài)的細(xì)胞，一般原代細(xì)胞可以傳1-2次后使用；盡量挑選迭代次數(shù)少的細(xì)胞，如果是凍存細(xì)胞，建議復(fù)蘇1-2h后使用；

4)選擇對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞；

5)做好支原體清除。

2.試劑添加：

1）電轉(zhuǎn)試劑的添加只需室溫操作即可；

2）細(xì)胞在試劑中停留不超20min，混合好盡快開(kāi)始實(shí)驗(yàn)；

3）轉(zhuǎn)染的底物占比不能大于總體積的10%，比如轉(zhuǎn)染體系100ul，底物最多添加10ul；

4）在消化的細(xì)胞進(jìn)行配置時(shí)，一定要離心并wan全去除殘留培養(yǎng)基；

5）在加入到電極杯中時(shí)，要避免產(chǎn)生氣泡，從而影響電脈沖；

6）對(duì)底物進(jìn)行內(nèi)毒素控制；

7）轉(zhuǎn)染試劑與底物濃度配比控制；

8）如果是mRNA轉(zhuǎn)染，可多洗滌2次。

3.程序設(shè)置：

1）使用Lonza電轉(zhuǎn)儀，程序已經(jīng)設(shè)定好，可以根據(jù)不同的細(xì)胞名稱(chēng)，選擇對(duì)應(yīng)的優(yōu)程序； 根據(jù)實(shí)際情況，可以對(duì)程序進(jìn)行微調(diào)，確保轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率。

2）使用需要自行設(shè)置的儀器，一般電場(chǎng)強(qiáng)度設(shè)置遵循低電場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程的原則。

4.細(xì)胞重懸：

1）轉(zhuǎn)染結(jié)束之后，可以先停留10min再加培養(yǎng)基重懸；

2）使用無(wú)鈣培養(yǎng)基重懸，5-10min后轉(zhuǎn)移細(xì)胞到培養(yǎng)皿上；

3）后續(xù)的實(shí)驗(yàn)一般在轉(zhuǎn)染后24h再進(jìn)行；

4）電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞，鋪板數(shù)量翻一倍。

5.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的培養(yǎng)：選擇表達(dá)高峰期細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，推薦文獻(xiàn)可在Lonza查詢。