氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(DTNB比色法)說明書

 氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(DTNB比色法)

產(chǎn)品貨號：BA1827

產(chǎn)品規(guī)格：100T

產(chǎn)品簡介：

谷胱甘肽(glutathione，GSH)存在于幾乎身體的每一個細胞，參與細胞許多功能活動，是一種氧自由基消除劑。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統(tǒng)的功能，保護組織細胞免受氧化損傷，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巰基為其活性基團，故常簡寫為G-SH或GSH，易與某些藥物(如撲熱息痛)、毒素(如自由基、碘乙酸、鉛、汞、砷等)等結(jié)合，具有整合解毒作用，在延緩衰老、增強免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用。谷胱甘肽是研究活性氧和自由基的重要指標，亦是機體氧化物牽累的重要指標。還原型谷胱甘肽 (GSH)是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，能可逆的轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸凸入赘孰?/span>(GSSG)，其存在形式會隨著細胞內(nèi)代謝的情況而發(fā)生相互轉(zhuǎn)變。

氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測試劑盒(DTNB比色法)(GSSG Assay Kit)是一種簡單易行的GSSG檢測的試劑盒，其檢測原理是谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH，由GSSG還原成的GSH和樣品本身含有的GSH都與發(fā)色底物DTNB反應(yīng)，生成黃色的TNB和GSSG，總谷胱甘肽(T-GSH，GSSG+GSH)就相當于一個呈色的限速反應(yīng)，T-GSH含量決定了黃色含量，用適當?shù)姆椒ㄏ惹宄龢悠分械?/span>GSH，然后利用GR將GSSG還原成GSH，通過分光光度法檢測412nm處吸光度，帶入回歸方程就可以計算出GSSG的量。該試劑盒可用于測定血漿、血清、植物或動物組織、細胞等樣品中氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，亦可檢測總谷胱甘肽(T-GSH)含量。該試劑盒僅用于科研，不用于臨床診斷或其他用途。

產(chǎn)品組成：

自備材料：

1. 離心管或小試管

2. 蒸餾水

3. PBS或生理鹽水

4. 勻漿器或研缽

5. 低溫離心機

6. 水浴鍋

7. 比色杯

8. 分光光度計

操作步驟(僅供參考):

1. 配制GSH標準儲存液：取10mg還原型谷胱甘肽(GSH)標準加入3.25ml ddH2O，溶解并混勻，即為還原型GSH標準儲存液(10mM)；一部分立即使用，其余適當分裝后-20℃保存。

2. 配制DTNB儲存液：該本試劑盒提供的80mg DTNB中加入2ml DMSO，溶解并混勻，即為DTNB儲存液(40mg/ml)；一部分立即使用，其余適當分裝后-20℃保存。

3. 配制50×GSH還原酶：按GSH還原酶原液:GSH Assay Buffer=1:49的比例混合，即為50×GSH還原酶；-20℃保存，3個月有效。

4. 配制GSH 檢測工作液：按下表配制GSH檢測工作液。

5. 配制T-GSH檢測工作液：按下表配制T-GSH檢測工作液。

6. 配制蛋白沉淀工作液：在本試劑盒提供的2.5g蛋白沉淀劑中加入50ml ddH2O，配制成50ml 5%的水溶液，即為蛋白沉淀工作液，4℃保存。

7. 配制標準品：把還原型GSH標準儲存液(10mM)用蛋白沉淀工作液稀釋成50μM標準溶液，然后依次稀釋成25、15、10、5、2μM GSH溶液，取50、25、15、10、5、2 μM GSH標準溶液6個點作標準曲線。注意：由于GSH標準在蛋白沉淀工作液中不太穩(wěn)定，用蛋白沉淀工作液配制的GSH溶液必須新鮮配制后使用，不可凍存后再使用。

8. 配制NADPH工作液：在本試劑盒提供的10mg NADPH中加入1ml ddH2O，溶解并混勻，即為NADPH儲存液(10mg/ml)。一部分立即使用，其余適當分裝后-20℃保存。按0.1ml NADPH儲存液(10mg/ml)加入8.23ml的比例加入GSH assay buffer，充分混勻，即為NADPH工作液(0.12mg/ml)。

9. 準備樣品：

①紅細胞或血漿樣品：取新鮮血液，600g離心10min，沉淀為紅細胞，上清為血漿。對于紅細胞，用PBS洗滌兩次，取約100μl紅細胞沉淀或血漿，加入100μl蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻。4℃或冰浴放置10min，4℃ 10000g離心10min，取上清，用于GSSG測定，樣品需暫時4℃保存?zhèn)溆茫涣⒓礈y定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天。對于處理好的紅細胞樣品最后需用蛋白沉淀工作液稀釋10倍后再進行后續(xù)的測定，而對于血漿樣品，應(yīng)直接取80μl進行測定。

②植物或動物組織樣品：取組織用液氮速凍迅速研磨，按每40mg加入100μl蛋白沉淀工作液 (亦可不用液氮，而是直接加入蛋白沉淀工作液至組織后勻漿或研磨)，充分Vortex振勻，再加入300μl蛋白沉淀工作液，用勻漿器充分勻漿。4℃孵育10min，4℃ 10000g離心10min，取上清，用于GSSG測定。樣品需暫時4℃保存?zhèn)溆?，不立即測定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天，對于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進行適當稀釋后再進行測定，稀釋倍數(shù)通常為5～20倍。

③細胞樣品：PBS洗滌細胞1次，離心收集細胞，吸盡上清，加入細胞沉淀3倍體積的蛋白沉淀工作液，充分Vortex振勻(收集細胞前后分別對離心管進行稱重，從而就可以計算出細胞沉淀的重量，10mg細胞沉淀的體積可以粗略地看做10ml。)對樣品進行快速的凍融后，4℃或冰上孵育5min，4℃ 10000g離心10min，取上清，用于GSSG測定。樣品需暫時4℃保存?zhèn)溆?，不立即測定的樣品可以-70℃保存，但不宜超過10天，對于處理好的組織樣品通常需用蛋白沉淀工作液進行適當稀釋后再進行測定，稀釋倍數(shù)通常為5～20倍。

10. GSH加樣：按照下表設(shè)置空白管、標準管、測定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的GSH濃度過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定。

11. T-GSH加樣：按照下表設(shè)置空白管、標準管、測定管，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的T-GSH濃度過高，可以減少樣品用量或適當稀釋后再進行測定。

12. GSH和T-GSH測定：立即用分光光度計或自動生化分析儀測定410nm處吸光度，每隔2min測定1次，空白管調(diào)零，共檢測6min(亦可加入NADPH工作液反應(yīng)6min后檢測，只檢測1次)，以檢測其反應(yīng)速率ΔA/min。如果分光光度計不能測定410nm，可測定405～420nm處吸光度。

計算： 

①動力學測定法：根據(jù)不同時間點測定得到的吸光度計算出ΔA₄₁₀/min，以GSH標準的濃度(50、25、15、10、5、2μM)為橫坐標，以ΔA₄₁₀/min為縱坐標，作出標準曲線，求出回歸方程。根據(jù)待測的ΔA₄₁₀/min，對照標準曲線的回歸方程可以計算出測定時測定時樣品還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

GSSG含量=總谷胱甘肽(T-GSH)的含量-還原型谷胱甘肽(GSH)含量

動力學法測定結(jié)果比終點測定法的結(jié)果精確，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計算出每毫克組織或細胞中的谷胱甘肽的含量，通過測定蛋白濃度，從而計算出樣品的蛋白量，最后計算出每mg蛋白中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

②終點測定法：即反應(yīng)6min僅測定1次吸光度的方法。以GSH標準的濃度(50、25、15、10、5、2μM)為橫坐標，以ΔA₄₁₀/min為縱坐標，作出標準曲線，求出回歸方程，對照標準曲線的回歸方程可以計算出測定時樣品中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。終點測定法比動力學法快捷，根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)、以及最初樣品的使用量，可以計算出每毫克組織或細胞中的谷胱甘肽的含量，通過測定蛋白濃度，從而計算出樣品的蛋白量，最后計算出每mg蛋白中還原型谷胱甘肽(GSH)和總谷胱甘肽(T-GSH)的含量。

GSSG含量=總谷胱甘肽(T-GSH)的含量-還原型谷胱甘肽(GSH)含量

參考區(qū)間：

          成年全血GSH    1.02±0.17mmol/L

注意事項：

1. GSH比較穩(wěn)定，血液樣品以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3～4周內(nèi)穩(wěn)定。

2. 請盡量使用新鮮的細胞或血液進行測定，而不要使用凍存的細胞或血液進行測定，避免使GSH活性下降。

3. 全血GSH與吸煙和鍛煉成正比。

4. 測定各管時，各孔溫度均需達到室溫或25℃，否則影響結(jié)果。

5. 輕度溶血樣本對GSH測定無影響。

6. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期：6個月有效。