Lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項

關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，有許多常用的轉(zhuǎn)染試劑。下面簡單介紹下Lipo3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞的步驟及注意事項。

實驗準(zhǔn)備：Lipofectamine™ 3000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM（可以用無血清的培養(yǎng)基代替）

實驗步驟：

1.接種細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時達(dá)到70–90%匯合度。

注：對于HEK293，6孔板一般鋪50萬個細(xì)胞左右。對于PC9, 24孔板一般鋪5-10萬個細(xì)胞。由于不同細(xì)胞，生長狀況不太一樣，需要根據(jù)情況調(diào)整。

2.使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine™ 3000試劑，充分混勻。

3.使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋DNA，制備DNA預(yù)混液，然后添加P3000™試劑，充分混勻。

4.將上面兩步溶液合在一起，混勻并孵育10-15mins。

5.將混勻后的溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，并輕輕搖晃培養(yǎng)基，使其均勻。

6.37°C孵育細(xì)胞2–4天，然后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

注意事項：

1.Opti-MEM需要37℃水浴鍋預(yù)熱。

2.轉(zhuǎn)染siRNA至細(xì)胞時，在稀釋siRNA時不要加入P3000™試劑。

3.關(guān)于Lipo3000的用量，比如6孔板推薦用量有兩個3.75ul和7.5ul，最di看轉(zhuǎn)染效率，zui高看細(xì)胞耐受。

4. Opti-MEM與Lipo3000預(yù)混及Opti-MEM、質(zhì)粒及P3000預(yù)混，都不需要各自孵育，而且兩者混合后孵育時間最多不要超過15mins。

5.轉(zhuǎn)染中和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中最好不要含有雙抗。

對于比較好轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如HEK293，而且需要大量轉(zhuǎn)染的時候，可以使用PEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，畢竟Lipo3000比較貴。例如，在做CO-IP實驗時，需要10cm皿轉(zhuǎn)染好幾種質(zhì)粒，就可以用PEI進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。