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ELISA測(cè)定的常用模式--間接法測(cè)抗體

來(lái)源:上海銳谷生物科技有限公司   2011年11月29日 15:27  
 
    基本方法的操作如下:
    1.將病原體的抗原在碳酸鹽緩沖液中4~C過(guò)夜包被,形成固相抗原,洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉,洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。   
    2.加入含待測(cè)抗體的臨床樣本如血清等,溫育一定時(shí)間后洗板;此時(shí),待測(cè)抗體就會(huì)與固陽(yáng)上特異抗原反應(yīng)而吸附于固相上。
    3.加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體,溫育一定時(shí)間后洗板;此時(shí),在固相上即形成固相抗原—待測(cè)抗體—酶標(biāo)二抗復(fù)合物。
    4.加入酶底物,溫育顯色測(cè)定(圖2—6)。
 
 
  間接法測(cè)抗體在目前應(yīng)用zui多的是丙型肝炎病毒抗體(抗HCV)、人免疫缺陷病毒抗體(抗HIV)以及梅毒螺旋體抗體等的測(cè)定。從上述的測(cè)定模式可見(jiàn),間接法測(cè)抗體,嚴(yán)格地講,所測(cè)定的僅為抗體的IgG類(lèi),不涉及IgM和IgA類(lèi),這是由酶標(biāo)二抗體所決定的。
 
    影響間接法測(cè)定抗體的一個(gè)較大的因素是包被抗原的純度。現(xiàn)在間接法測(cè)抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原,如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋體TpNl5,TpNl7,TpN47等?;蚬こ炭乖诩兓瘯r(shí)應(yīng)盡量去除用來(lái)表達(dá)的宿主如大腸桿菌的抗原,以免由于機(jī)體存在對(duì)這種宿主抗原的抗體而引起假陽(yáng)性反應(yīng)。此外,由于機(jī)體的IgG類(lèi)抗體濃度較高,其中絕大部分為機(jī)體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG,因此,為避免這些高濃度非特異IgG對(duì)固相的吸附所致的假陽(yáng)性反應(yīng),通常需對(duì)待測(cè)樣本做一定程度的稀釋。

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