腫瘤干細(xì)胞與微腫瘤培養(yǎng)技術(shù)的介紹

1. 簡(jiǎn)介

越來越多的證據(jù)表明，腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性（Heterogeneity）和可塑性（Plasticity）。腫瘤中的一小群具有無限增殖潛能的、能重建腫瘤發(fā)生的細(xì)胞被稱作腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cell），又稱腫瘤起始細(xì)胞（Tumour initiating cell）。腫瘤干細(xì)胞通過自我更新和分化在腫瘤中維持相對(duì)穩(wěn)定的比例。腫瘤干細(xì)胞通常處于相對(duì)靜止的細(xì)胞周期，對(duì)放療和化療藥物不敏感，在某些刺激因子作用下重新進(jìn)入細(xì)胞周期從而快速增殖，導(dǎo)致腫瘤的耐藥和復(fù)發(fā)。此外，腫瘤干細(xì)胞可通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-to-mesenchymal transtion）和免疫逃逸轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)端，造成腫瘤轉(zhuǎn)移。

微腫瘤是一種全新的基于患者來源的原代腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)方法（Patient-Derived Tumor-like Cell Clusters，PTC）而建立了腫瘤體外藥敏檢測(cè)模型【1】。微腫瘤 PTC 是由腫瘤干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞組成，能夠很好地再現(xiàn)腫瘤組織本身的多細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤上皮細(xì)胞的相互作用【2】。

2. 技術(shù)方法

2.1腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)方法

目前，腫瘤干細(xì)胞的常用培養(yǎng)方法主要包括有非粘附培養(yǎng)、支架培養(yǎng)、三維培養(yǎng)、懸滴培養(yǎng)及生物反應(yīng)器培養(yǎng)等【3】。

非粘附培養(yǎng)：將腫瘤細(xì)胞以單細(xì)胞懸浮的形式培養(yǎng)在非粘附的培養(yǎng)皿上，利用無血清或低血清的培養(yǎng)基來促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的形成和增殖。這種方法可以選育單個(gè)腫瘤干細(xì)胞克隆，并適用于體外測(cè)定干細(xì)胞特性。

支架培養(yǎng)：將腫瘤細(xì)胞種植到三維支架（如纖維素支架、蛋白質(zhì)支架等）上，提供細(xì)胞外基質(zhì)支持和三維空間結(jié)構(gòu)，模擬體內(nèi)腫瘤的微環(huán)境。這種方法可以促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞自我更新和多向分化。

三維培養(yǎng)：將腫瘤細(xì)胞種植在三維球體或凝膠中，形成立體結(jié)構(gòu)。這種培養(yǎng)方法能夠模擬體內(nèi)腫瘤組織的結(jié)構(gòu)和功能，提供更逼真的腫瘤微環(huán)境。

懸滴培養(yǎng)：將腫瘤細(xì)胞以單細(xì)胞懸浮的形式滴入培養(yǎng)基中，形成懸滴培養(yǎng)系統(tǒng)。這種方法可以使腫瘤細(xì)胞形成球體，提供類似體內(nèi)的3D環(huán)境。

生物反應(yīng)器培養(yǎng)：利用生物反應(yīng)器（如旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器、旋轉(zhuǎn)殼層生物反應(yīng)器等）提供動(dòng)態(tài)環(huán)境參數(shù)，如流體剪切力、氧濃度、pH值等，模擬體內(nèi)腫瘤的生物物理特性。

2.2微腫瘤的培養(yǎng)方法【4】

在用于微腫瘤培養(yǎng)前，將腫瘤細(xì)胞維持在低吸附的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

為形成微腫瘤，使用含GlutaMAX添加劑和10% FBS、1X非必需氨基酸、100 U/mL青霉素-鏈霉素以及25 mM HEPES的Gibco DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞以100–5,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到Nunclon Sphera 96孔U形底培養(yǎng)板中（200 μL/孔）。

同時(shí)，使用含3%甲基纖維素的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞接種到未處理培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板以250 x g離心5分鐘。

隨后，將細(xì)胞置于37°C和5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)，每72小時(shí)換液，即使用多通道移液器從每孔中移除100μL培養(yǎng)基并補(bǔ)充100 μL新鮮培養(yǎng)基。

3. 應(yīng)用

3.1靶向腫瘤干細(xì)胞，推進(jìn)新藥研發(fā)

在臨床相關(guān)性方面，研究已證實(shí)，癌癥干細(xì)胞對(duì)化療和放療具有天然的耐藥性。此外，抑制治療或微環(huán)境誘導(dǎo)的分化的癌細(xì)胞（即非癌癥干細(xì)胞）向癌癥干細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是腫瘤的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。來自美國(guó)NIH等機(jī)構(gòu)的4位科學(xué)家系統(tǒng)匯總了靶向Notch、WNT、Hedgehog和Hippo通路的療法到目前為止的臨床開發(fā)進(jìn)展。同時(shí)，文章還討論了癌癥干細(xì)胞與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，并概述了靶向癌癥干細(xì)胞的新型免疫療法【5】。

3.2癌癥疫苗的開發(fā)

來自美國(guó)密歇根大學(xué)外科助理教授Qiao Li博士及同事從兩類免疫活性的小鼠模式動(dòng)物中提取腫瘤干細(xì)胞，并將其制備成疫苗。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)接收該腫瘤干細(xì)胞疫苗注射的小鼠CTL細(xì)胞能夠在體外殺死腫瘤干細(xì)胞【6】。Xu等的研究發(fā)現(xiàn)CSC疫苗能夠在接種疫苗的小鼠中顯著激發(fā)對(duì)自體腫瘤抗原的免疫反應(yīng),顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了存活時(shí)間，并減少了晚期卵巢癌 組織中的 CSC 計(jì)數(shù)【7】。

4.參考文獻(xiàn)

【1】Yin S, Xi R, Wu A, Wang S, Li Y, Wang C, Tang L, Xia Y, Yang D, Li J, Ye B, Yu Y, Wang J, Zhang H, Ren F, Zhang Y, Shen D, Wang L, Ying X, Li Z, Bu Z, Ji X, Gao X, Jia Y, Jia Z, Li N, Li Z, Ji JF, Xi JJ. Patient-derived tumor-like cell clusters for drug testing in cancer therapy. Sci Transl Med. 2020 Jun 24;12(549):eaaz1723.

【2】http: //oncol.dxy.c n/article/711882

【3】郭德志,張建鵬.腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)與分選鑒定的研究進(jìn)展[J].癌變.畸變.突變, 2023, 35(1):63-66.

【4】https: //w ww.thermofisher。。ｃｎ/cn/zh/home/life-science/cell-culture/ cell-culture- learning-center/cell-culture-resource-library/cell-culture-transfection-application-notes/harnessing-new-dimensions-research-coming-round-spheroid-culture.html

【5】Clara JA, Monge C, Yang Y, Takebe N. Targeting signalling pathways and the immune microenvironment of cancer stem cells - a clinical update. Nat Rev Clin Oncol. 2020 Apr;17(4):204-232. doi: 10.1038/s41571-019-0293-2. Epub 2019 Dec 2. PMID: 31792354.

【6】Ning N, Pan Q, Zheng F, Teitz-Tennenbaum S, Egenti M, Yet J, Li M, Ginestier C, Wicha MS, Moyer JS, Prince ME, Xu Y, Zhang XL, Huang S, Chang AE, Li Q. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 2012 Apr 1;72(7):1853-64. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-1400. PMID: 22473314; PMCID: PMC3320735.

【7】Xu H, Zhao F, Wu D, Zhang Y, Bao X, Shi F, Cai Y, Dou J. Eliciting effective tumor immunity against ovarian cancer by cancer stem cell vaccination. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114547. doi: 10.1016/j.biopha.2023.114547. Epub 2023 Mar 16. PMID: 36933377.