植物組織中總氮、蛋白質(zhì)氮含量的測定（微量凱氏法——）

來源：北京三品科創(chuàng)儀器有限公司 作者：zsg.spkc 時間：2009.7.8

 氮素代謝在植物的新陳代謝中占主導(dǎo)地位。植物組織中有機氮化物的含量隨著植物的生理狀況及環(huán)境條件的不同而發(fā)生變化。所以測定其含量，對研究植物的氮素吸收、運輸和代謝規(guī)律，以及確定農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)、營養(yǎng)價值等具有一定意義。

    一、原理

    植物組織中的有機氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量無機氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子?？杉尤肴纫宜?，使其zui終濃度為5％，將蛋白質(zhì)沉淀出來，分別測定總氮、蛋白氮或非蛋白氮；通常只測定總氮或蛋白氮。將植物材料與濃硫酸共熱，硫酸分解為二氧化硫、水和原子態(tài)氧，并將有機物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮轉(zhuǎn)變成氨，并進一步生成硫酸銨。為了加速有機物質(zhì)的分解，在消化時通常加入多種催化劑，如硫酸銅、硫酸鉀和硒粉等。消化完成后，加入過量NaOH，將NH₄⁺轉(zhuǎn)變成NH₃，通過蒸餾把NH₃導(dǎo)入過量的硼酸溶液中，再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)原來的氫離子濃度。滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸摩爾數(shù)即為NH₃的摩爾數(shù)，通過計算，可得出含氮量。
    蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜的含氮化合物，每種蛋白質(zhì)都有其恒定的含氮量，（約在14％～18％，平均約含氮16％）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100／16＝6.25），算出蛋白質(zhì)的含量。若以總氮含量乘以6.25，就是樣品的粗蛋白含量。試樣中若含有硝態(tài)氮時，首先要使硝態(tài)氮還原為銨態(tài)氮，可加入水楊酸和硫代硫酸鈉，使硝態(tài)氮與水楊酸在室溫下作用生成硝基水楊酸，再用硫代硫酸鈉粉使硝基水楊酸轉(zhuǎn)化為銨鹽。由于水楊酸與硫代硫酸鈉會消耗一部分硫酸，所以消化時的硫酸用量要酌情增加。

    二、材料、儀器設(shè)備及試劑

    （一）材料：各種干燥、過篩（60～80目）的植物樣品

    （二）儀器設(shè)備：1. 消化管；2. 微量凱氏定氮蒸餾裝置一套（圖17）；3. 三角燒瓶；4.微量滴定管；5. 量筒；6. 容量瓶；7. 燒杯；8. 移液管等。

    三、實驗步驟

    （一）樣品提取分離：準(zhǔn)確稱取烘至恒重的樣品0.1000g～0.5000g（依樣品含氮量而定，含氮1～3mg宜），置10ml離心管中，加入5ml5％三氯乙酸，90℃水浴中浸提15min，不時攪拌，取出后用少量蒸餾水沖洗玻棒，待溶液冷卻后，4000rpm離心15min，上清液棄去。并用5％三氯乙酸洗沉淀2～3次，離心，棄去上清液，zui后用蒸餾水將沉淀無損地洗入鋪有濾紙的漏斗上，去掉濾液后，將沉淀和濾紙在50℃下烘干，用于蛋白氮的測定。

（二）樣品的消化：取4支消化管編號。1號管直接放入稱好的材料用于測定總氮，2號管放入上述烘干的濾紙和沉淀，用于蛋白氮的測定，3號管放入同樣濾紙一張、4號管不加任何樣品作為空白對照，注意將樣品放入消化管底部。向各消化管加濃硫酸5ml，混合催化劑0.3g～0.5g，將樣品浸泡數(shù)h或放置過夜后，在管口蓋一小漏斗，放在遠紅外消煮爐上加熱消化。開始時溫度可稍低，以防止內(nèi)容物上升至管口。泡沫多時，可從小漏斗加入2～3滴無水乙醇。到管口出現(xiàn)白色霧狀物時，泡沫已不再產(chǎn)生；此時可逐漸升溫，使內(nèi)容物達到微沸。直到消化液變?yōu)榍宄和该鳛橹埂Ｏ^程中，若在消化管上部發(fā)現(xiàn)有黑色顆粒時，應(yīng)小心地轉(zhuǎn)動消化管，用消化液將它沖洗下來，以保證樣品消化*。消化過程約需2～3h。

    （三）定容消化完畢待溶液冷卻后，沿管壁仔細加入10ml左右無氨蒸餾水，以沖洗管壁，再將消化液小心轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中。以無氨水少量多次沖洗消化管，洗滌液并入容量瓶。冷卻后用無氨水定容至刻度，混勻備用。

    （四）蒸餾及滴定 以下幾步進行：
1.儀器的洗滌：先經(jīng)一般洗滌后，還要用水蒸氣洗滌?？砂聪铝蟹椒ㄟM行蒸氣洗滌。先在蒸氣發(fā)生器中加入2／3體積的蒸餾水（事先加入幾滴濃硫酸，使其酸化，加入甲基紅指示劑，并加入少許沸石或毛細玻璃管以防止爆沸）。打開漏斗下的夾子，用電爐或酒精爐加熱至沸騰，使水蒸氣通入儀器的各個部分，以達到清洗的目的。在冷凝管下端放置一個三角瓶接收冷凝水。然后關(guān)緊漏斗下的夾子，繼續(xù)用蒸氣洗滌5min。沖洗完畢，夾緊蒸氣發(fā)生器與收集器之間的連接橡膠管，蒸餾瓶中的廢液由于減壓而倒吸進入收集器，打開收集器下端的活塞排除廢液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下端換放一個盛有硼酸－指示劑混合液的三角瓶，使冷凝管下口*浸沒在液面以下0.5cm處，蒸餾1～2min，觀察三瓶內(nèi)的溶液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內(nèi)部已洗干凈。移去三角瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水沖洗冷凝管下口，關(guān)閉電爐，儀器即可供測定樣品使用。

2.標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測定為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)，并檢驗實驗的準(zhǔn)確性，找出系統(tǒng)誤差，常用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨測試三次。在三角瓶中加入20ml硼酸－指示劑混合液，將此三角瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸入溶液中。注意在加樣前務(wù)必打開收集器活塞，以免三角瓶內(nèi)液體倒吸。準(zhǔn)確吸取2ml硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)溶液，加到漏斗中。

    四、結(jié)果計算
    樣品中總氮量（％）＝0.010×（V₃—V₀）×100×14/（W×1000×10）×100×氮的回收率
    樣品中蛋白氮含量（％）＝0.0100×（V₁－V₂－V₀）×100×14/（W×5×1000）×100×氮的回收率
    回收率（％）＝0.0100×（V－V₀）×14/（2.0×0.6×100）×100