關(guān)于拉曼模型的深度探討

一、前言：

過(guò)去20年來(lái)，拉曼光譜法在制藥應(yīng)用中取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。晶型分析是拉曼在分析實(shí)驗(yàn)室的藥物分析中提供的一項(xiàng)功能，以及用于顆粒、基質(zhì)和表面分析的拉曼光譜共聚焦顯微鏡功能。

從2010年代末開(kāi)始，手持式拉曼系統(tǒng)在制藥領(lǐng)域的應(yīng)用激增。這些儀器配置了專(zhuān)用操作系統(tǒng)，用于GMP環(huán)境中的輔料和API定性分析、固體劑型確認(rèn)和防偽分析，現(xiàn)在已成為事實(shí)上的高效GMP原材料來(lái)料檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

生物過(guò)程監(jiān)測(cè)是光譜平臺(tái)非常適用的領(lǐng)域。早在20世紀(jì)90年代末，近紅外和中紅外光譜系統(tǒng)就已被研究用于生物過(guò)程代謝物監(jiān)測(cè)應(yīng)用，但水對(duì)紅外光譜的吸收嚴(yán)重限制了可用于吸收測(cè)量的光程，從而導(dǎo)致檢測(cè)背景噪音過(guò)大。拉曼光譜受益于相對(duì)較弱的水散射截面，因此從本世紀(jì)初開(kāi)始研究拉曼光譜的這種應(yīng)用也就不足為奇了。拉曼技術(shù)在光學(xué)采樣表面也提供了相當(dāng)大的靈活性，無(wú)論使用塑料、玻璃和其他礦物質(zhì)作為采樣接觸表面的干擾都非常小。

早期拉曼生物過(guò)程工作的重點(diǎn)領(lǐng)域是各種生物系統(tǒng)中的細(xì)胞代謝物，并且隨著人們的興趣迅速擴(kuò)大，這種應(yīng)用仍在繼續(xù)。許多研究者還發(fā)表了關(guān)于評(píng)估關(guān)鍵產(chǎn)品質(zhì)量屬性的可能性文獻(xiàn)，如蛋白質(zhì)翻譯后修飾和聚合等的相關(guān)研究。

根據(jù)Google Scholar的 數(shù)據(jù)，過(guò)去10年，與“Raman+ BioProcess”相關(guān)的引用呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)（圖1），到2023年，引用次數(shù)將超過(guò)4000次。

二、傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>的挑戰(zhàn)：

 復(fù)雜生物系統(tǒng)中拉曼數(shù)據(jù)的分析需要計(jì)算輔助。正如Ryder所評(píng)論的那樣，在這項(xiàng)工作中可以采用多種化學(xué)計(jì)量學(xué)和多變量工具。關(guān)于關(guān)鍵工藝參數(shù)和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CPP 和   CQA）的建模，絕大多數(shù)文獻(xiàn)中采用偏最小二乘  (PLS)  回歸。PLS  是一大類(lèi)潛變量/正則化經(jīng)驗(yàn)線性校準(zhǔn)方法之一。它在化學(xué)應(yīng)用中占據(jù)明顯主導(dǎo)地位的原因很大程度上是歷史和商業(yè)原因，但它相比于其他方法并沒(méi)有更好的表現(xiàn)。不過(guò)所有經(jīng)驗(yàn)方法確實(shí)都有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即幾乎不需要詳細(xì)了解底層細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、分析儀器的物理化學(xué)原理。

但是，使用這些經(jīng)驗(yàn)校準(zhǔn)方法對(duì)生物過(guò)程數(shù)據(jù)進(jìn)行建模存在一些重大挑戰(zhàn)，如下所示：

1, 非平穩(wěn)性(Nonstationarity)和方差齊性(Homoscedastivity)：在數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)中，“平穩(wěn)性”是一個(gè)術(shù)語(yǔ)，意味著每個(gè)數(shù)據(jù)（在本研究中為光譜數(shù)據(jù)）都是從具有固定分布特性的隨機(jī)分布中得出的。大多數(shù)商業(yè)軟件中的 P LS  等經(jīng)驗(yàn)方法僅在理論上是準(zhǔn)確的，并且是使用“平穩(wěn)”數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化的。這意味著每個(gè)生物反應(yīng)過(guò)程必須以相同的方式運(yùn)行，并且化學(xué)物質(zhì)之間具有一致的相關(guān)性。它還意味著儀器中的測(cè)量方差在時(shí)間和通道上始終相同（方差齊性）。對(duì)于拉曼光譜（或近紅外或中紅外光譜吸收）來(lái)說(shuō)，情況并非如此，特別是在生物過(guò)程中，當(dāng)大量生物量(Biomass)可能導(dǎo)致生物反應(yīng)過(guò)程運(yùn)行中或不同批次之間的熒光差異非常大時(shí)，從而導(dǎo)致數(shù)據(jù)噪音波動(dòng)顯現(xiàn)數(shù)量級(jí)的差異。

2, 協(xié)變量：根據(jù)定義，在生物反應(yīng)過(guò)程中許多物質(zhì)之間存在時(shí)間相關(guān)性。廣泛使用的經(jīng)驗(yàn)方法旨在利用這些經(jīng)驗(yàn)時(shí)間相關(guān)性；但這些關(guān)聯(lián)方法非常容易產(chǎn)生非特異性關(guān)聯(lián)，從而降低預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和通用性。

3, 可交換性和交叉驗(yàn)證：與上述兩點(diǎn)相關(guān)，交叉驗(yàn)證通常作為數(shù)據(jù)建模工作中經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)驗(yàn)證評(píng)估來(lái)完成。為了使交叉驗(yàn)證結(jié)果有效且具有代表性，數(shù)據(jù)必須是“可交換的”；但由于協(xié)變量的原因，生物過(guò)程數(shù)據(jù)通常嚴(yán)重違反了這一原則。

4, 試錯(cuò)法：這些經(jīng)驗(yàn)方法中的大多數(shù)都包括變量選擇、預(yù)處理、歸一化和校正方法的一系列選項(xiàng)。推薦的方法是“嘗試一下，看看什么似乎有效”，因?yàn)橥ǔ](méi)有什么理論依據(jù)來(lái)指導(dǎo)選擇這種方法而不是另一種方法。

5, 質(zhì)量因數(shù)：與上述內(nèi)容相關(guān)，大多數(shù)商業(yè)軟件中報(bào)告的主要指標(biāo)是“RMSEC/RMSECV/RMSEP”：[校準(zhǔn)/交叉驗(yàn)證/預(yù)測(cè)]的均方根誤差]。藥典分析標(biāo)準(zhǔn)通常期望對(duì)選擇性、線性、精密度、檢測(cè)限和靈敏度進(jìn)行估計(jì)；但不幸的是，經(jīng)驗(yàn)建模方法不能直接估計(jì)這些質(zhì)量因數(shù)。用戶(hù)可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)工作來(lái)評(píng)估這些值，但這是相當(dāng)具有挑戰(zhàn)性的，通常需要定制化的編程/分析。

6, 光譜儀變化：當(dāng)開(kāi)發(fā)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜁r(shí)，單個(gè)光譜儀的個(gè)體特性和非理想效應(yīng)也會(huì)成為開(kāi)發(fā)者的協(xié)變量。當(dāng)更換光譜儀或更換激光器/探測(cè)器時(shí)，經(jīng)常需要校正多變量模型以確保與新光譜儀的個(gè)體相關(guān)性。經(jīng)常需要使用多種數(shù)學(xué)方法來(lái)執(zhí)行這種“校準(zhǔn)遷移”。

7, 監(jiān)管挑戰(zhàn)：經(jīng)驗(yàn)建模方法的?箱性質(zhì)需要廣泛的經(jīng)驗(yàn)驗(yàn)證工作來(lái)證明其靈敏度、選擇性、線性和穩(wěn)定性。監(jiān)管指導(dǎo)文件（如ICH Q 14 10.3）中提供了一些通用指南，但它們并不是特別明確，也不是以這些方法的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)為理論依據(jù)。

考慮到這些挑戰(zhàn)，毫無(wú)疑問(wèn)，穩(wěn)健的拉曼方法開(kāi)發(fā)和部署一直是生物反應(yīng)過(guò)程應(yīng)用中特別棘手的挑戰(zhàn)。人們已經(jīng)做出了許多努力來(lái)克服其中的一些障礙。設(shè)計(jì)故意擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)可用于試圖“打破”本質(zhì)上存在的協(xié)變量并擴(kuò)大可用于建模的經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)的范圍。

不同文獻(xiàn)報(bào)告了使用  PLS 和 各種預(yù)處理方法成功構(gòu)建“通用”模型，并報(bào)告在特定平臺(tái)方法的合理成功；但這些工作通常涉及  25?30  次以上的生物反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，需要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力物力；并且還不包括隨后的實(shí)驗(yàn)部署和維護(hù)成本。這些文獻(xiàn)結(jié)果與行業(yè)研討會(huì)報(bào)告的內(nèi)容思路基本一致。 

三、Maverick的全新模型：

我們的目標(biāo)是改善將拉曼光譜方法引入生物反應(yīng)過(guò)程監(jiān)測(cè)的技術(shù)挑戰(zhàn)。我們從哺乳動(dòng)物 C HO  和  HEK293  細(xì)胞系開(kāi)始，這些細(xì)胞系廣泛用于蛋白質(zhì)(單抗)和病毒載體的生產(chǎn)，并且可用于放大生產(chǎn)。

僅憑借純粹的經(jīng)驗(yàn)建模/校準(zhǔn)很難規(guī)避上述挑戰(zhàn)?；旌夏Ｐ驮谏飳W(xué)和生物反應(yīng)過(guò)程領(lǐng)域越來(lái)越受到關(guān)注。迄今為止，這些方法在很大程度上結(jié)合了基本生物機(jī)制的知識(shí)、化學(xué)工程知識(shí)、計(jì)算流體動(dòng)力學(xué)和其他知識(shí)領(lǐng)域，以及使用一些經(jīng)驗(yàn)測(cè)量或觀察的數(shù)據(jù)，以提高對(duì)生物反應(yīng)過(guò)程的理解。模型中更多的固定元素限制了經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化，以降低過(guò)度擬合/局部最小值的風(fēng)險(xiǎn)，并引導(dǎo)整體模型達(dá)到可解釋且產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的近似值。使用第一性原理或構(gòu)建砌塊信息來(lái)預(yù)測(cè)復(fù)雜的結(jié)果有時(shí)被稱(chēng)為全新的方法，例如全新的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模，這是我們用來(lái)描述Maverick算法原理的術(shù)語(yǔ)。

MAVERICK的全新模型源自1970年代開(kāi)始研究的關(guān)于多變量校準(zhǔn) ( MVC)  的概率框架，例如Morgan等人的早期研究。它與圖2中常見(jiàn)的經(jīng)驗(yàn)多變量校準(zhǔn)模型形成對(duì)比。

在存在一些參考誤差(e)的情況下，經(jīng)驗(yàn)MVC方法根據(jù)觀測(cè)到的光譜數(shù)據(jù) X (X~)和配對(duì)參考數(shù)據(jù)(y)  的近似值來(lái)估計(jì)預(yù)測(cè)變量b；b本身的計(jì)算是基本的。上述挑戰(zhàn)1-7主要表現(xiàn)在每個(gè)領(lǐng)域中‘X’的近似值上，應(yīng)該做什么實(shí)驗(yàn)、在什么硬件上、設(shè)置哪些參數(shù)、在計(jì)算b之前應(yīng)該如何修正/處理原始數(shù)據(jù)，以及最終的模型在真正預(yù)期的條件下如何執(zhí)行。

X的近似值對(duì)于控制經(jīng)驗(yàn)方法過(guò)度擬合的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要，并且在實(shí)踐中有許多、許多、許多不同的X  (X~)的可能“近似值”。  PLS（偏最小二乘法）是許多模型方法之一，在許多商用軟件中廣泛使用。在創(chuàng)建X（X~）的過(guò)程中，也通常會(huì)消除波長(zhǎng)范圍或應(yīng)用其他線性或非線性變換。過(guò)多可用于建模的‘近似’步驟選項(xiàng)是過(guò)度擬合的重要次級(jí)來(lái)源，因此有時(shí)會(huì)需要評(píng)估數(shù)百或數(shù)千個(gè)選項(xiàng)，浪費(fèi)了大量的廣義自由度。

相比之下，MAVERICK  的全新模型不使用任何憑經(jīng)驗(yàn)觀察到的X或y數(shù)據(jù)。相反，它使用圖2中術(shù)語(yǔ)（一些靜態(tài)和一些動(dòng)態(tài)）在時(shí)間t為主動(dòng)測(cè)量下的系統(tǒng)創(chuàng)建“最佳線性預(yù)測(cè)器” 。雖然這個(gè)模型的核心是概率性的，但它的幾個(gè)關(guān)鍵參數(shù)可以直接從基于光學(xué)、電子學(xué)和多元統(tǒng)計(jì)學(xué)的第一性原理中推導(dǎo)出來(lái)。由于這些效應(yīng)在拉曼系統(tǒng)中是動(dòng)態(tài)的，所以觀察生物反應(yīng)過(guò)程，幾個(gè)模型選項(xiàng)也是動(dòng)態(tài)的（這不足為奇）。

公式中參數(shù)K,Ψ代表可觀察拉曼光譜可能的化學(xué)/生物化學(xué)貢獻(xiàn)者的“主要參數(shù)”以及相關(guān)的預(yù)測(cè)概率密度函數(shù)，從中產(chǎn)生濃度估計(jì)值。人們可能想知道，如何才能涵蓋公式中的所有可能性。雖然生物反應(yīng)過(guò)程中化學(xué)/生化物質(zhì)的數(shù)量很可能有數(shù)千種。但拉曼光譜的靈敏度意味著人們實(shí)際上只需要考慮0.01  g/L 以 上的主要成分。在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)基中，超過(guò)0.01g/L的，我們發(fā)現(xiàn)數(shù)百種常用物質(zhì)以及添加劑（例如表面活性劑、消泡劑）的數(shù)據(jù)。用那么多參數(shù)數(shù)據(jù)對(duì)觀測(cè)到的拉曼光譜進(jìn)行去卷積通常是一個(gè)不合適的問(wèn)題；但使用全新模型，是一個(gè)充分自我調(diào)節(jié)的解決方案，以產(chǎn)生低方差的濃度估值。

其余條件既取決于設(shè)備，也取決于時(shí)間。F是從每個(gè)MAVERICK系統(tǒng)的多維出廠特征導(dǎo)出的濾波器函數(shù)，并且實(shí)時(shí)適應(yīng)于變化的樣本和系統(tǒng)條件。拉曼系統(tǒng)中許多重大誤差來(lái)自于光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)和電子原件。MAVERICK的內(nèi)部系統(tǒng)模型使其能夠?qū)崟r(shí)估計(jì)∑t 的測(cè)量誤差協(xié)方差。相應(yīng)的，系統(tǒng)模型還允許Et自適應(yīng)，例如變化的室內(nèi)照明、溫度和濁度條件。最后，由于在生物反應(yīng)過(guò)程中，時(shí)間t的系統(tǒng)狀態(tài)與時(shí)間t-1的狀態(tài)有關(guān)，因此惰性模型中包括環(huán)境和自回歸分量（Λ）。

質(zhì)量因數(shù)

這個(gè)估計(jì)模型的幾個(gè)重要性質(zhì)先前已經(jīng)討論過(guò)，例如預(yù)測(cè)均方誤差（MSEP）的解析解。

如上所述，經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ烷_(kāi)發(fā)中的一個(gè)一致性挑戰(zhàn)是模型屬性的不透明性。很少有證明生物過(guò)程拉曼應(yīng)用文獻(xiàn)引用所得模型的標(biāo)準(zhǔn)分析優(yōu)值，例如靈敏度、選擇性、LOD，因?yàn)槎嘧?/span>量模型的文獻(xiàn)定義很復(fù)雜。符合IUPAC定義的靈敏度和選擇性因子可以根據(jù)文獻(xiàn)中所述的過(guò)程全新模型直接估計(jì)。最后，還可以推斷出其他模型診斷，如平面內(nèi)和平面外一致性，類(lèi)似于Hoteling或杠桿統(tǒng)計(jì)和F參數(shù)：

四、                      模型快速校準(zhǔn)：

MAVERICK系統(tǒng)的MAVERICK方法減輕了用戶(hù)的巨大建模負(fù)擔(dān)，但并不能使其擺脫所有形式的“校準(zhǔn)”。由于MAVERICK系統(tǒng)被設(shè)計(jì)為在測(cè)量模塊、光路模塊和探頭之間即插即用，因此在開(kāi)始生物反應(yīng)過(guò)程分析之前，需要進(jìn)行一個(gè)準(zhǔn)備步驟來(lái)確認(rèn)定量系統(tǒng)的適用性。這是一個(gè)3步過(guò)程，由MAVERICK的軟件在HUB屏幕上引導(dǎo)：

1.       將拉曼探頭浸入“LOW”標(biāo)準(zhǔn)液中，按下  ‘GO’并等待大約4分鐘；

2.       將拉曼探頭浸入“HIGH”標(biāo)準(zhǔn)液中，按下  ‘GO’并等待大約4分鐘；

3.       將拉曼探頭插入反應(yīng)器中與反應(yīng)器一起滅菌；

步驟1+2檢查MAVERICK+探頭的一些參數(shù)是否符合全新模型，并對(duì)MAVERICK測(cè)量模型、光路模塊和探頭的特定組合的全新模型輸出進(jìn)行快速的標(biāo)品定標(biāo)。該參數(shù)還允許對(duì)使用帶序列號(hào)和芯片的探頭進(jìn)行自動(dòng)的審計(jì)追蹤。MAVERICK還支持單點(diǎn)“實(shí)時(shí)”校準(zhǔn)，這有助于消除離線分析儀器和MAVERICK之間的數(shù)據(jù)偏差。

五、                      實(shí)測(cè)案例：

圖3顯示了與一些常見(jiàn)的離線生化分析儀（酶膜法）相比，使用MAVERICK在CHO和HEK293工藝上的分析數(shù)據(jù)。

圖4展示了全新模型提供的一些后臺(tái)診斷信息。這些信息是從CHO培養(yǎng)過(guò)程中提取的，該過(guò)程在一個(gè)有大窗戶(hù)的實(shí)驗(yàn)室中運(yùn)行。在上圖中，在估計(jì)的RMSE（g/L）中可觀察到的小波動(dòng)與預(yù)期一致——全新模型正在跟蹤整個(gè)晝夜周期的基本背景噪音變化，影響∑t。同樣的影響正在傳播到下圖中對(duì)葡萄糖的選擇性，該圖繪制了葡萄糖對(duì)前20種其他細(xì)胞培養(yǎng)基成分的選擇性：隨著環(huán)境光照的增加，盡管環(huán)境光照發(fā)生了變化，但全新模型仍進(jìn)行了調(diào)整和自適應(yīng)，以保持選擇性。谷胱甘肽以綠色曲線顯示，雖然它恰好是該生物過(guò)程中葡萄糖選擇性“較低”的物種，但正如y軸所示，葡萄糖選擇性仍然很好（>0.99）。

在生物過(guò)程的后期階段，細(xì)胞/蛋白質(zhì)濃度的增加可以誘導(dǎo)中重度的自發(fā)熒光，這會(huì)給經(jīng)驗(yàn)校準(zhǔn)模型帶來(lái)很大的困難。全新模型的優(yōu)值反映了這種影響，可以觀察到RMSE的緩慢上升趨勢(shì)，但由于全新模型持續(xù)跟蹤和補(bǔ)償背景噪音的增加，從測(cè)量誤差模型中的熒光來(lái)看，這種影響處理得相當(dāng)良好。

六、                      Maverick全新模型的限制與機(jī)會(huì)

全新模型的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)—即透明度和避免經(jīng)驗(yàn)推導(dǎo)模型的陷阱—也可以被認(rèn)為是其關(guān)鍵局限性。如上所述，如果生物過(guò)程的光學(xué)活性成分沒(méi)有提前確認(rèn)，則全新模型報(bào)告的結(jié)果容易有偏差。數(shù)據(jù)偏差的程度在很大程度上取決于‘未知’物質(zhì)的光學(xué)活性：低微克/升水平的痕量金屬元素不會(huì)產(chǎn)生影響，因?yàn)閍）它們是光學(xué)無(wú)活性的，b）濃度太低，無(wú)法在溶液中用拉曼觀察到。通常，只有0.01g/L及以上范圍內(nèi)的共價(jià)鍵合有機(jī)物質(zhì)才被認(rèn)為是相關(guān)的。

全新模型也無(wú)法支持所謂的“間接傳感器”—即沒(méi)有直接的光譜效應(yīng)（如pH），也可以從經(jīng)驗(yàn)觀測(cè)數(shù)據(jù)中推斷出虛擬參數(shù)。如果沒(méi)有公式包含的光譜效應(yīng)，就無(wú)法使用全新模型。對(duì)于那些對(duì)間接傳感器建?；驍U(kuò)展預(yù)測(cè)模型感興趣的人，可以選擇將MAVERICK的全光譜導(dǎo)出，該導(dǎo)出可以通過(guò)OPCUA實(shí)時(shí)訪問(wèn)，也可以在測(cè)量會(huì)話結(jié)束時(shí)作為合并數(shù)據(jù)文件訪問(wèn)。

還有更多的機(jī)會(huì)利用Ψ和K的混合建模方法。目前，單個(gè)Ψ似乎足以用于哺乳動(dòng)物的生物過(guò)程，但我們正在探索更多樣的自適應(yīng)Ψ培養(yǎng)基系統(tǒng)（例如非CHO或HEK293哺乳動(dòng)物細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞等）。或者，如果從數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)明顯不存在的特定配方組分，則對(duì)K的動(dòng)態(tài)進(jìn)行約束。例如，通過(guò)L1型正則化方法。我們注意到，動(dòng)態(tài)系統(tǒng)模型（如所謂的數(shù)字孿生）也可能直接與全新模型連接，進(jìn)行連續(xù)的時(shí)間數(shù)據(jù)更新。

七、                      后語(yǔ)：

隨著我們?cè)谄渌治鑫锖推渌?xì)胞/培養(yǎng)基過(guò)程中驗(yàn)證性能，我們有機(jī)會(huì)繼續(xù)擴(kuò)展MAVERICK的參數(shù)。此外，隨著流程從早期工藝開(kāi)發(fā)過(guò)渡到中試和生產(chǎn)規(guī)模，全新模型的靈活性可以幫助提高跨規(guī)模/幾何結(jié)構(gòu)的工藝穩(wěn)定性。