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Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)
Trizol是一種酸性試劑，能從細(xì)胞和組織中快速分離RNA，其主要成分為異硫氰酸胍(GITC)和苯酚。裂解細(xì)胞后，GITC能使蛋白質(zhì)和RNase變性，有利于保護(hù)RNA的完整性；加入氯仿離心后，樣品分為水相和有機(jī)相，RNA存在于上層水相中，而DNA和蛋白質(zhì)則存在于中間層及下層有機(jī)相中，從而達(dá)到分離的目的。簡(jiǎn)單來(lái)講就是裂解細(xì)胞使RNA得以釋放，加之有機(jī)溶劑使RNA與DNA、蛋白質(zhì)分離，并進(jìn)一步純化得到RNA的過(guò)程。那么你知道Trizol法RNA提取的實(shí)驗(yàn)流程和注意事項(xiàng)是什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！
1.樣品的制備
1)細(xì)胞：按1ml Trizol試劑/5-10×10^6細(xì)胞的比例加入Trizol試劑(注：一般來(lái)講待細(xì)胞在六孔板上生長(zhǎng)至80%左右時(shí)，每孔收集的細(xì)胞加1ml Trizol即可)；
2)組織：按1ml Trizol試劑/50-100mg組織的比例加入Trizol試劑并在冰上勻漿處理，以利于RNA的釋放(注：組織可以先用液氮急凍后研磨處理，也可用勻漿器或者組織研磨器進(jìn)行處理，但要注意保持低溫，以防RNA降解)；
室溫裂解5-10min。
2.氯仿抽提
每1ml Trizol中加入200ul的氯仿，蓋好EP管蓋后用手劇烈顛倒混勻15s左右，室溫孵育2-3min。2-8℃，12000g離心15min后溶液分為三層，從上到下依次為水相(RNA)、中間層及有機(jī)相(DNA、蛋白質(zhì)等)，轉(zhuǎn)移水相至新的EP管中(注：此步一定要小心謹(jǐn)慎，慢慢吸取，不可觸及中間層，以免RNA被污染)。
3.異丙醇沉淀
每1ml Trizol中加入500ul異丙醇，上下顛倒混勻后，室溫孵育10min，2-8℃，12000g離心10min，得到的白色沉淀即為RNA沉淀(注：異丙醇最好提前預(yù)冷，維持低溫環(huán)境，以防RNA被降解)。
4.乙醇洗滌
棄去上清，加入1ml 75%乙醇(每1ml Trizol)洗滌RNA沉淀，2-8℃，7500g離心5min(注：75%乙醇可以用無(wú)水乙醇及無(wú)酶水來(lái)配制，同樣最好預(yù)冷處理；清洗時(shí)動(dòng)作要輕柔，過(guò)于劇烈會(huì)導(dǎo)致RNA沉淀散開(kāi)，再次離心未免會(huì)重聚，從而造成RNA的損失)。
5.溶解
棄去上清，于通風(fēng)櫥內(nèi)干燥RNA沉淀5-10min，用50ul左右的無(wú)酶水重懸沉淀，即可得到RNA溶液(注：干燥時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，太過(guò)干燥會(huì)導(dǎo)致沉淀很難溶解，部分溶解的RNA的260/280的比值會(huì)大大降低，甚至低于1.6；亦可采用金屬浴60℃，5min以助溶)。
6.RNA質(zhì)量的檢測(cè)
1)微量分光光度計(jì)
純RNA的260/280比值在2.0左右，若比值偏小，則代表可能有蛋白或有機(jī)溶劑的污染，比值偏大則代表RNA可能發(fā)生降解。
2)瓊脂糖凝膠電泳
可見(jiàn)三條帶，從上往下一般為28s RNA、18s RNA及5s RNA，一般情況下5s的帶非常淡，甚至看不清，28s帶的亮度應(yīng)為18s帶亮度的2倍，且不存在拖尾，即可證明RNA純度可以，如若5s很明顯，而28s 與18s帶的亮度并無(wú)太大差別，甚至出現(xiàn)涂抹狀的條帶則高度提示RNA降解。
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