磷酸化 NF-κB p65 (Ser536) (93H1) 兔單克隆抗體產(chǎn)品信息

反應(yīng)性HMR Hm Mk Pg

靈敏度內(nèi)源性

分子量（kDa）65

來源/同種型兔免疫球蛋白G

產(chǎn)品使用信息

應(yīng)用稀釋

蛋白質(zhì)印跡法1：1000

Simple Western™1:10 - 1:50

免疫沉淀1:50

免疫熒光（免疫細胞化學(xué)）1:800 - 1:3200

流式細胞儀（固定/透化）1:800 - 1:3200

貯存 含有 10 mM HEPES 鈉 (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 疊氮化na。儲存于 –20°C。不要等分抗體。

蛋白質(zhì)印跡實驗方案 對于蛋白質(zhì)印跡，將膜與稀釋的一抗在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween ® 20 中一起在 4°C 下孵育過夜，并輕輕搖動。  注意：請參閱一抗產(chǎn)品網(wǎng)頁了解推薦的抗體稀釋度。

A. 溶液和試劑 從樣品制備到檢測，您的蛋白質(zhì)印跡所需的試劑現(xiàn)在都在一個方便的套件中：#12957蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用解決方案套件  注：用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水制備溶液。  

20X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)：( #9808 ) 要制備 1 L 1X PBS：將 50 ml 20X PBS 添加到 950 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 緩沖鹽水 (TBS)：( #12498 ) 要制備 1 L 1X TBS：將 100 ml 10X 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

1X SDS 樣品緩沖液：藍色上樣包 ( #7722 ) 或紅色上樣包 ( #7723 ) 通過將 1/10 體積的 30X DTT 添加到 1 體積的 3X SDS 上樣緩沖液中來制備新鮮的 3X 還原性上樣緩沖液。用 dH 2 O稀釋至 1X。

10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液：( #4050 ) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液：將 100 ml 10X 電泳緩沖液添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris-甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液：( #12539 ) 要制備 1 L 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液：將 100 ml 10X 轉(zhuǎn)移緩沖液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH 2 O 中，混合。

10X Tris 緩沖鹽水與 Tween ® 20 (TBST)：( #9997 ) 要制備 1 L 1X TBST：將 100 ml 10X TBST 添加到 900 ml dH 2 O 中，混合。

脫脂奶粉：（#9999）。

封閉緩沖液：1X TBST，含 5% w/v 脫脂奶粉；對于 150 毫升，將 7.5 克脫脂奶粉添加到 150 毫升 1X TBST 中并充分混合。

洗滌緩沖液：( #9997 ) 1X TBST。

牛血清白蛋白 (BSA)：( #9998 )。

一抗稀釋緩沖液：1X TBST，含 5% BSA；對于 20 ml，將 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。

生物素化蛋白梯檢測包：( #7727 )。

藍色預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)記物，寬范圍 (11-250 kDa)：( #59329 )。

印跡膜和紙：( #12369 ) 該方案已針對硝酸纖維素膜進行了優(yōu)化。通常建議孔徑為 0.2 µm。

與 HRP 綴合的二抗：抗兔 IgG、HRP 連接抗體 ( #7074 )。

檢測試劑：SignalFire™ ECL 試劑 ( #6883 )。

B. 蛋白質(zhì)印跡 樣品制備的通用方案。

通過添加含有調(diào)節(jié)劑的新鮮培養(yǎng)基來處理細胞所需的時間。

從文化中吸取介質(zhì)；用 1X PBS 清洗細胞；吸出。

添加 1X SDS 樣品緩沖液（6 孔板每孔 100 µl，10 cm 直徑板每孔 500 µl）裂解細胞。立即從板上刮下細胞并將提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管中。保持在冰上。

超聲處理 10–15 秒以完成細胞裂解并剪切 DNA（以降低樣品粘度）。

將 20 µl 樣品加熱至 95–100°C 5 分鐘；在冰上冷卻。

微量離心 5 分鐘。

將 20 µl 上樣到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。  

注：建議加載預(yù)染色分子量標(biāo)記（#59329，10 µl/泳道）以驗證

電轉(zhuǎn)移和生物素化蛋白質(zhì)梯（#7727，10 µl/泳道）以確定分子量。  

電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 ( #12369 )。

C. 膜封閉和抗體孵育

注：體積適用于 10 cm x 10 cm (100 cm 2 ) 的膜；對于不同尺寸的膜，相應(yīng)地調(diào)整體積。  

I. 膜封閉

（可選）轉(zhuǎn)膜后，用 25 ml TBS 室溫清洗硝酸纖維素膜 5 分鐘。

將膜在 25 ml 封閉緩沖液中室溫孵育 1 小時。

用 15 ml TBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘。

二.一抗孵育

將膜和一抗（按照產(chǎn)品網(wǎng)頁中推薦的適當(dāng)稀釋度和稀釋劑）在 10 ml 一抗稀釋緩沖液中孵育，并在 4°C 下輕輕攪拌過夜。

用 15 ml TBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘。

將膜與抗兔 IgG、HRP 連接抗體 ( #7074 at 1:2000) 和抗生物素、HRP 連接抗體 ( #7075 at 1:1000–1:3000) 一起孵育，以檢測 10 ml 溶液中的生物素化蛋白質(zhì)標(biāo)記物室溫下輕輕攪拌封閉緩沖液 1 小時。

用 15 ml TBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘。 繼續(xù)檢測（D 部分）。

D. 蛋白質(zhì)檢測

使用指南：

在 TBST 中洗滌膜結(jié)合的 HRP（抗體偶聯(lián)物） 3 次，每次 5 分鐘。

通過稀釋一份 2X 試劑 A 和一份 2X 試劑 B（例如，對于 10 ml，添加 5 ml 試劑 A 和 5 ml 試劑 B）來制備 1X SignalFire™ ECL 試劑 ( #6883 )。攪拌均勻。

將基質(zhì)與膜一起孵育 1 分鐘，除去多余的溶液（膜保持濕潤），用塑料包裹并暴露于 X 射線膠片。

* 避免反復(fù)接觸皮膚。