使用 3Dye 差異蛋白質(zhì)組試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記

差異蛋白質(zhì)組學(xué)可以比較來(lái)自不同生物來(lái)源的大量蛋白質(zhì)。通常的例子是經(jīng)過(guò)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞、不同的細(xì)菌菌株。即使蛋白質(zhì)譜中的微小差異也可以通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)發(fā)現(xiàn)。

Lumiprobe 3Dye 套件包含 Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 染料，它們的光譜不同，但遷移率匹配。因此，用這些染料標(biāo)記的蛋白質(zhì)在凝膠電泳中共同遷移。由于使用染料進(jìn)行的蛋白質(zhì)標(biāo)記依賴于 NHS 酯化學(xué)，因此賴氨酸殘基是標(biāo)記的主要位點(diǎn)。

二維蛋白質(zhì)組學(xué)的最佳實(shí)踐意味著使用合并的內(nèi)部對(duì)照樣本，該樣本本質(zhì)上是在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中分析的兩個(gè)樣本的混合物。內(nèi)部對(duì)照樣品用 Cyanine2 標(biāo)記，分析樣品用 Cyanine3 或 Cyanine5 標(biāo)記（這兩種染料可以互換）。

3Dye 試劑以 5 nmol、10 nmol 和 25 nmol 包裝進(jìn)行預(yù)先測(cè)量。染料被凍干以延長(zhǎng)其保質(zhì)期。每個(gè)包裝在使用前均應(yīng)用 DMF 重新配制。 DMF 質(zhì)量對(duì)于實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)品保質(zhì)期至關(guān)重要。套件中的染料附帶 DMF。

蛋白質(zhì)混合物的制備是測(cè)定中變化最大、要求最高的部分。它超出了協(xié)議的范圍，因?yàn)椴煌臉悠沸枰浅２煌牧呀鈼l件才能獲得適合檢測(cè)的蛋白質(zhì)混合物。本質(zhì)上，被比較的兩個(gè)樣品應(yīng)該在相同的條件下裂解以獲得有意義的結(jié)果。一般來(lái)說(shuō)，如果實(shí)驗(yàn)需要裂解，建議使用基于 CHAPS 的裂解溶液。

在比較兩種蛋白質(zhì)混合物的制備后，可以使用以下方案來(lái)實(shí)現(xiàn)標(biāo)記：

1. 通過(guò)每 1 nmol 每種染料添加 1 μL DMF（來(lái)自試劑盒），制備每種染料的 1 mM 庫(kù)存溶液。這些溶液在 -20°C 下可穩(wěn)定保存三個(gè)月。為了確保保質(zhì)期，在打開前將管干燥、全解凍，在關(guān)閉前盡可能用惰性氣體吹掃。

2. 使用無(wú)胺緩沖液（NaHCO3、醋酸鹽）或 Tris 緩沖液將蛋白質(zhì)混合物 pH 調(diào)節(jié)至 8.5。在單獨(dú)的小瓶中，準(zhǔn)備三個(gè)用于標(biāo)記的蛋白質(zhì)樣品：(1) 第一個(gè)蛋白質(zhì)樣品，(2) 第二個(gè)蛋白質(zhì)樣品，以及 (3) 兩者的混合物（合并的內(nèi)部對(duì)照）。每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)濃度理想情況下應(yīng)為 5–10 mg/mL，但也可以使用低至 1 mg/mL 的濃度。每次反應(yīng)取 50 μg 蛋白質(zhì)。

3. 通過(guò)取等分的 1 mM 庫(kù)存溶液并用 DMF 稀釋至 0.4 mM 來(lái)制備染料工作溶液。

4. 將 1 μL 工作染料溶液添加到反應(yīng)混合物中：Cyanine3 表示未處理，Cyanine5 表示處理過(guò)（反之亦然），Cyanine2 表示合并的內(nèi)部對(duì)照。通過(guò)移入和移出混合每個(gè)反應(yīng)，并在黑暗中放置 30 分鐘。

5. 通過(guò)向每種溶液中添加 1 μL 10 mM 賴氨酸來(lái)停止反應(yīng)（試劑盒中不包含該試劑，但該試劑很容易獲得）。

6. 合并三個(gè)樣品并運(yùn)行 2D 凝膠。

7. 使用任何能夠檢測(cè) Cyanine2、Cyanine3 和 Cyanine5 的成像儀進(jìn)行分析?？梢詮哪z上切下蛋白質(zhì)斑點(diǎn)并通過(guò)質(zhì)譜分析。