海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

海馬神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
1、儀器
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，解剖鏡，眼科鑷，眼科剪
2、動(dòng)物
新生鼠（SD大鼠）
3、耗材
DMEM/F12培養(yǎng)基、聚賴氨酸
實(shí)驗(yàn)步驟：
包被：培養(yǎng)前一天將培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶或皿用0.01%多聚賴氨酸包被過夜。第二天早上來吸除包被液在無菌超凈臺(tái)中自然晾干后放置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中備用。
配制神經(jīng)元專用培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基中添加1%谷氨酰胺，2% B27，1%雙抗）
取腦：選取新生24h之內(nèi)的SD大鼠數(shù)只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,斷頭處死,無菌條件下分層剪開頭皮,顱骨,用彎鑷?yán)_腦區(qū)視野，小心取出全腦，用預(yù)冷的PBS洗數(shù)次；
分離：以腦中線為起點(diǎn)，小心撥開大腦顳葉皮層，暴露出新月狀海馬回，小心夾出海馬組織，置于預(yù)冷的PBS中，仔細(xì)剔除微血管，用眼科剪充分剪碎組織。
消化：加入同體積0.125%的胰蛋白酶，放入CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化30分鐘，期間每隔5分鐘輕搖一下。
過濾：加入數(shù)滴胎牛血清終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞數(shù)分鐘，至液體成米糊狀即停止吹打，動(dòng)作務(wù)必輕柔，用200目細(xì)胞篩過濾收集細(xì)胞懸液。
接種：1000rpm離心5分鐘，去除上清，用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕吹打，調(diào)整細(xì)胞濃度為100000個(gè)每毫升，接種于包被好禁止晃動(dòng)；
換液：6小時(shí)后將DMEM/F12培養(yǎng)液全量換成神經(jīng)元專用培養(yǎng)液，第48小時(shí)后加入一定濃度的阿糖胞苷，以抑制非神經(jīng)元細(xì)胞過度生長(zhǎng)，隨后每3天半量換液。