上期我們了解到在 SILAC 的實(shí)驗(yàn)中會(huì)用到同位素標(biāo)記的氨基酸，而體內(nèi)的代謝實(shí)驗(yàn)中是否也會(huì)有專門的同位素標(biāo)記物的使用呢？今天就和 M 君一起來(lái)看下體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)中同位素標(biāo)記物的應(yīng)用吧

穩(wěn)定同位素標(biāo)記物是研究代謝的有力工具，越來(lái)越多地用于體內(nèi)代謝研究，穩(wěn)定同位素標(biāo)記物在體內(nèi)代謝研究中已經(jīng)解決了許多生物學(xué)問(wèn)題，如：代謝路徑的確認(rèn)、疾病機(jī)理的探索、新調(diào)控原理的發(fā)現(xiàn)、新治療靶點(diǎn)及生物標(biāo)志物的確認(rèn)、新診斷方法的實(shí)施及個(gè)性化治等[1]。
穩(wěn)定同位素標(biāo)記物在代謝研究中這么重要，一般都有哪些同位素標(biāo)記物的示蹤劑呢?它們是如何區(qū)別并應(yīng)用的呢？跟著 M 君繼續(xù)來(lái)了解吧~

常用的示蹤劑有穩(wěn)定和放射兩種同位素示蹤劑，穩(wěn)定同位素示蹤劑因其標(biāo)記方式靈活多樣、示蹤時(shí)長(zhǎng)不受半衰期限制、給藥方式多樣及示蹤通路研究較多等而受到體內(nèi)代謝研究實(shí)驗(yàn)的追捧。

穩(wěn)定同位素示蹤劑應(yīng)用較多的為含氘 (2H)、碳-13 (13C)、碳-15 (15N)、氧-18 (18O) 等的同位素標(biāo)記物，全標(biāo)記的示蹤劑具有作為全局示蹤劑的潛力目前廣泛用于代謝研究中，它們可以一次將標(biāo)記轉(zhuǎn)移到多個(gè)下游途徑中，研究多個(gè)通量，如全 13C 標(biāo)記的葡萄糖 (D-Glucose-13C₆) 和谷氨酰胺 (L-Glutamine-13C₅) 等，通過(guò)給藥體內(nèi)，可分析下游代謝產(chǎn)物，找出上下游代謝途徑及其它們的內(nèi)在關(guān)系、代謝產(chǎn)物的組成和含量等，甚至研究細(xì)胞代謝的動(dòng)態(tài)變化。

圖 1. R. solanacearum F1C1 中通過(guò)13C標(biāo)記確認(rèn)OxPPP 和 Non-OxPPP 代謝途徑^[2]。

而特定位置標(biāo)記的穩(wěn)定同位素示蹤劑因其在特定位置的同位素原子會(huì)轉(zhuǎn)移到特定的代謝物中，對(duì)研究特定通路方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前也被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)代謝研究匯中，如有 [1-13C]-glucose 和 [1，2-13C]-glucose 在研究葡萄糖是參與的有氧化磷酸戊糖 (OxPPP) 還是非氧化磷酸戊糖 (Non-OxPPP) 途徑中發(fā)揮了重大作用[2]。用 3 個(gè) 13C 標(biāo)記的果糖 [1,2,3-13C or 4,5,6-13C]-fructose 示蹤劑，通過(guò)使用在果糖標(biāo)記在前 3個(gè)碳原子，后 3個(gè)碳原子的不同位置標(biāo)記物，揭示了果糖主要通過(guò)甘油在小鼠小腸中分解為有機(jī)酸的過(guò)程[3]。

圖 2. 小鼠接受未標(biāo)記的葡萄糖和部分標(biāo)記的果糖 (碳 1,2,3 或 4,5,6 標(biāo)記)的 1:1 混合物。循環(huán)甘油，以及在較小程度上幾種其他有機(jī)酸，優(yōu)先由果糖的碳 4、5、6 形成。紅線表示碳 1、2、3 與碳 4、5、6 的標(biāo)記相等 (1、2、3 的 N = 4, 4、5、6 的 N = 3) ^[3]。

不同的同位素示蹤劑有不同的用途，那我們要如何選擇呢？M君帶你進(jìn)入了解大咖是如何篩選及后處理同位素的體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)的!  

如何篩選穩(wěn)定同位素示蹤劑來(lái)進(jìn)行體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)?zāi)兀縅uan Fernández-Garcí 教授等人對(duì)用不同穩(wěn)定同位素做體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)做了匯總，并總結(jié)了體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)總流程圖，具體的過(guò)程如下：

1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的穩(wěn)定同位素示蹤劑，示蹤劑的選擇必須有某個(gè)代謝途徑來(lái)驅(qū)動(dòng)，這些代謝途徑的研究正好解決目前實(shí)驗(yàn)需要解決的生物學(xué)問(wèn)題，然后用不同方法摻入模型生物體內(nèi)，如輸液/注射、灌胃/飲食等。
2. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇，從受試者身上收集組織或者血液樣本。
3. 對(duì)收集的樣本代謝物的提取，如組織樣本處理時(shí)要控制好溫度和時(shí)間，減少對(duì)代謝的擾動(dòng)。
4. 上機(jī)檢測(cè)。根據(jù)提取的代謝物，使用質(zhì)譜 (MS) 或者核磁 (NMR) 等分析技術(shù)，檢測(cè)代謝物。
5. 數(shù)據(jù)分析。根據(jù)示蹤劑與下游代謝物的檢測(cè)情況，評(píng)估不同代謝物的同位素富集。根據(jù)所檢測(cè)代謝物數(shù)據(jù)分析，依據(jù)系統(tǒng)代謝模型，確認(rèn)代謝物狀態(tài)及途徑。

圖 3. 體內(nèi)示蹤實(shí)驗(yàn)總流程圖^[1]。

此時(shí)穩(wěn)定同位素在體內(nèi)代謝研究中的應(yīng)用已掌握了吧？下面 M 君給出一點(diǎn)小Tips:

在篩選穩(wěn)定同位素示蹤劑做體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議參考以下幾點(diǎn)建議：

1. 同位素標(biāo)記物的穩(wěn)定性：穩(wěn)定同位素標(biāo)記物要在體內(nèi)穩(wěn)定存在，且不干擾生物體的正常代謝過(guò)程。
2. 同位素標(biāo)記物的代謝途徑：在體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)中，需了解所選擇穩(wěn)定同位素標(biāo)記物的代謝途徑和產(chǎn)物。標(biāo)記物要被代謝，不干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3. 同位素標(biāo)記物的使用方法：在體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)中，需了解如何在體內(nèi)摻入穩(wěn)定同位素標(biāo)記物及實(shí)驗(yàn)方法，后續(xù)的樣品處理和數(shù)據(jù)分析。
4. 同位素標(biāo)記物的成本：標(biāo)記物價(jià)格比非標(biāo)記物要貴些，要權(quán)衡考慮實(shí)驗(yàn)數(shù)量和實(shí)驗(yàn)周期等因素，參考實(shí)驗(yàn)預(yù)算，以保證實(shí)驗(yàn)順利完成。

小 M 已和您共同學(xué)習(xí)了穩(wěn)定同位素在體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用，您是否也正好在做類似的實(shí)驗(yàn)?zāi)兀靠梢詾g覽下 MCE 的穩(wěn)定同位素標(biāo)記物，你想要的我都有！

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參考文獻(xiàn)：
[1] Fernández-García J, Altea-Manzano P, Pranzini E, Fendt SM. Stable Isotopes for Tracing Mammalian-Cell Metabolism In Vivo. Trends Biochem Sci. 2020 Mar;45(3):185-201

[2] Jyoti P, Shree M, Joshi C, Prakash T, Ray SK, Satapathy SS, Masakapalli SK. The Entner-Doudoroff and Nonoxidative Pentose Phosphate Pathways Bypass Glycolysis and the Oxidative Pentose Phosphate Pathway in Ralstonia solanacearum. mSystems. 2020 Mar 10;5(2):e00091-20.

[3] Jang C, Hui S, Lu W, Cowan AJ, Morscher RJ, Lee G, Liu W, Tesz GJ, Birnbaum MJ, Rabinowitz JD. The Small Intestine Converts Dietary Fructose into Glucose and Organic Acids. Cell Metab. 2018 Feb 6;27(2):351-361.e3.