你知道嗎？健康的肝臟具有幾乎無限的再生潛能！ 嚙齒類動(dòng)物的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)肝臟的一部分被手術(shù)切除時(shí)，肝臟可以在幾天內(nèi)恢復(fù)到原來的大小……

人體肝臟約占體重的 2%，研究發(fā)現(xiàn)成人的肝臟具有顯著的再生能力，健康情況下，肝臟處于有絲分裂靜止?fàn)顟B(tài)，但在毒性損傷或切除后，肝臟細(xì)胞可以迅速進(jìn)入細(xì)胞周期以恢復(fù)肝臟質(zhì)量和功能[1]。

肝臟再生是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種細(xì)胞類型的相互作用，包括肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞。通常情況下，肝細(xì)胞和 BECs 的增殖負(fù)責(zé)肝臟再生。盡管肝臟具有顯著的再生能力，但在急性損傷時(shí)，肝細(xì)胞和 BECs 逐漸喪失再生能力，并在各種慢性肝病中發(fā)生凋亡或衰老 (圖 1)。

圖 1. 肝臟再生機(jī)制^[1]。

(A) 在肝臟穩(wěn)態(tài)中，肝細(xì)胞和膽道上皮細(xì)胞 (BECs) 自我更新，而肝星狀細(xì)胞 (hsc) 大部分處于靜止?fàn)顟B(tài)。常駐巨噬細(xì)胞清除受損細(xì)胞和消耗的紅細(xì)胞，并控制病原體從母體進(jìn)入。(B) 在急性細(xì)胞損傷期間，肝細(xì)胞和膽道細(xì)胞增殖增加以重建受損組織，巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞碎片并切換到促修復(fù)表型。(C) 在慢性肝細(xì)胞損傷中，大量肝細(xì)胞衰老，剩余的非衰老肝細(xì)胞增殖不足以恢復(fù)受損組織。作為導(dǎo)管反應(yīng)的一部分，BECs 擴(kuò)張，可以檢測到膽道源性肝細(xì)胞。巨噬細(xì)胞被激活，但在這種情況下，與急性損傷相比，不同表型的巨噬細(xì)胞之間的比例發(fā)生了變化，因此更多的促炎巨噬細(xì)胞積聚，引發(fā)明顯的免疫反應(yīng)，激活hsc?；罨脑煅杉?xì)胞 (aHSCs) 有助于細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 的沉積和肝纖維化的發(fā)展。因此，慢性損傷以肝細(xì)胞衰老、炎癥和纖維化為特征。MMP: 基質(zhì)金屬蛋白酶；TIMP：金屬蛋白酶組織抑制劑。

由于缺乏恢復(fù)肝細(xì)胞再生的療法，肝移植成為終末期肝病的治療選擇。

3 月 14 日，Stefan Zwirner 團(tuán)隊(duì)在 Cell 發(fā)表突破性研究，其開發(fā)出的小分子 MKK4 抑制劑 --HRX215[2]。揭示了其具有突破腫瘤肝臟手術(shù)界限的潛力。

MKK4 是一種 MAP2 激酶，是應(yīng)激激活蛋白激酶 (SAPK)/絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的一部分。當(dāng)細(xì)胞暴露于不同的應(yīng)激刺激時(shí)，MKK4 會(huì)被激活。MKK4 的下游底物是 JNK 1、2 和 3，它們也被 MKK7 激活，而 p38 MAPK 亞型則主要被 MKK3 和 MKK6 激活。
已有研究發(fā)現(xiàn)，短發(fā)夾 RNA (shRNA) mir 介導(dǎo)的 MKK4 沉默可通過破壞 SAPK 信號(hào)傳導(dǎo) (主要通過 MKK7 和 JNK1 向 ATF2 和 ELK1 介導(dǎo)的下游促再生轉(zhuǎn)錄程序) 來釋放急性或慢性損傷肝臟中肝細(xì)胞的內(nèi)源再生能力[3]。

圖 2. 體內(nèi) RNAi 篩選確定 MKK4 是肝臟再生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子^[3]。

在此次研究中，科學(xué)家通過 MKK4 shRNA 轉(zhuǎn)基因小鼠，證實(shí)了肝細(xì)胞中的 MKK4 基因抑制可增強(qiáng)肝再生，在經(jīng)過長達(dá) 12 個(gè)月的全身性 MKK4 抑制的安全性評(píng)估后，發(fā)現(xiàn)通過抑制 MKK4 促進(jìn)肝臟再生且不增加肝臟腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。
于是研究者進(jìn)一步啟動(dòng)了以 MKK4 為治療靶點(diǎn)的藥物發(fā)現(xiàn)過程，通過共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)成功分離出晶體，但由于檢測中的各種阻礙，無法建立可利用的 ATP 結(jié)合袋模型，研究者將目光轉(zhuǎn)向了已報(bào)道的蛋白激酶抑制劑 Vemurafenib，經(jīng)過進(jìn)一步的先導(dǎo)化合物優(yōu)化產(chǎn)生了一系列 MKK4 抑制候選物。基于對(duì) JNK1、BRAF 和 MKK7 的 >100 倍選擇性，HRX215 被選為臨床候選藥物。

圖 3. HRX215 發(fā)現(xiàn)及合成途徑^[2]。

在藥物經(jīng)過了細(xì)胞膜通透性及藥代動(dòng)力學(xué)特性分析后，開始了進(jìn)一步的小鼠體內(nèi)藥理學(xué)分析，在 CCL₄ 誘導(dǎo)的肝損傷模型中，HRX215 增加部分肝切除后的肝細(xì)胞增殖并減弱細(xì)胞凋亡。同時(shí)，在酒精性脂肪性肝炎 (ASH) 模型和慢性 CCL₄ 治療誘導(dǎo)的肝纖維化模型中測試 MKK4i 時(shí)觀察到抗脂肪變性和抗纖維化功效。

機(jī)制上，當(dāng)給予 MKK4i 的小鼠接受部分肝切除術(shù)時(shí)，抑制 MKK4 后肝細(xì)胞中的促再生信號(hào)傳導(dǎo)依賴于增加的 MKK7 和 JNK1 信號(hào)傳導(dǎo)以及下游轉(zhuǎn)錄因子 ATF2 和 ELK1 的激活，先前的關(guān)鍵信號(hào)事件再次得到證實(shí)。

圖 4. MKK4 抑制劑 HRX215 可增強(qiáng)肝再生并預(yù)防肝衰竭^[2]。

豬肝切除模型可以進(jìn)行 80% 或 85% 肝切除，該模型忠實(shí)地反映了人類的肝臟再生，于是作者分別在 80% 和 85% 肝切除模型中研究 HRX215。在 80% 肝切除模型中，8 頭豬被隨機(jī)分配接受 HRX215 或?qū)φ罩委煛氖中g(shù)前 24 小時(shí)開始，每 12 小時(shí)靜脈注射 HRX215 (5 mg/kg) 或?qū)φ蛰d體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HRX215 介導(dǎo)的 MKK4 抑制可增加豬肝切除模型中的肝細(xì)胞再生，并且，HRX215 介導(dǎo)的肝再生促進(jìn)有效預(yù)防了豬 85% 肝切除術(shù)后的致命性 PHLF (post-hepatectomy-liver-failure, 肝后切除術(shù))。
在安全性上，HRX215 對(duì)心血管、神經(jīng)或呼吸系統(tǒng)沒有任何影響，并且在嚙齒類動(dòng)物和非嚙齒類動(dòng)物中進(jìn)行的 4 周毒性研究中 (大鼠為 300 mg/kg/天，狗為 250 mg/kg/天)，沒有藥物-觀察到相關(guān)毒性，未觀察到不良反應(yīng)水平。
此外，臨床候選 HRX215 進(jìn)行了人體 I 期試驗(yàn) (歐盟藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)臨床試驗(yàn) [EudraCT] 2021-000193-28)，結(jié)果顯示其具有出色的安全性和藥代動(dòng)力學(xué)。這使 HRX215 用于預(yù)防/治療廣泛腫瘤肝切除后或小移植物移植后肝衰竭成為可能。

本次研究中，作者開發(fā)出的小分子 MKK4 抑制劑 --HRX215。HRX215 的之處在于其強(qiáng)大的促再生作用、潛在的作用機(jī)制以及即使在 HRX215 長期治療后也具有出色的安全性。這肝切除提供了新的可能，從而為更多結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者和原發(fā)性肝癌患者提供潛在的治療前景。

Vemurafenib Vemurafenib (PLX4032) 是的，有效的 B-RAF 選擇性抑制劑，能夠抑制 RAFV600E 和 c-RAF-1 的活性，IC50 分別為 31 nM 和 48 nM。

Carbon tetrachloride Carbon tetrachloride 通過交感神經(jīng)通路誘導(dǎo)急性肝損傷。Carbon tetrachloride 引起肝纖維化和肝毒性。Carbon tetrachloride 具有口服活性。

MKK4 蛋白, Mouse (sf9, His-GST) MKK4 蛋白是參與 MAP 激酶途徑的雙特異性激酶。它通過優(yōu)先選擇 Thr 或 Tyr 殘基的磷酸化來激活應(yīng)激激活蛋白激酶 (JNK)。

ATF2 抗體 ATF2 Antibody 是一個(gè)非偶聯(lián)、分子量約 52 kDa、兔源、抗 ATF2 單克隆抗體。它可用于人、小鼠、大鼠背景下 WB 實(shí)驗(yàn)，且不帶標(biāo)記。

alpha Tubulin 抗體 alpha Tubulin Antibody 是一個(gè)非偶聯(lián)、分子量約 50 kDa、兔源、抗 alpha Tubulin 單克隆抗體。它可用于人、小鼠、大鼠、倉鼠背景下 WB、IHC-F、IHC-P、ICC/IF、IP 實(shí)驗(yàn)，且不帶標(biāo)記。

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參考文獻(xiàn)：

[1] Campana L, et al. Liver regeneration and inflammation: from fundamental science to clinical applications. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Sep;22(9):608-624.

[2] Zwirner et al., First-in-class MKK4 inhibitors enhance liver regeneration and prevent liver failure, Cell (2024)

[3] Wuestefeld T, et al. A Direct in vivo RNAi screen identifies MKK4 as a key regulator of liver regeneration. Cell. 2013 Apr 11;153(2):389-401.