TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡原理和經(jīng)驗(yàn)

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡原理和經(jīng)驗(yàn)
細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類(lèi)方法稱(chēng)為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法。
由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。由此，TUNEL成為了檢測(cè)DNA片段化（細(xì)胞凋亡）的方法。
TUNEL檢測(cè)：使用10 U/ml Dnase處理Hela細(xì)胞10分鐘
關(guān)鍵步驟:
1.充分脫蠟和水化
脫蠟可以先 60oC20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻；
2. 把握好細(xì)胞通透的時(shí)間。
一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用 10-30min，幾 μm 切片用短時(shí)間；幾十 μm 切片用長(zhǎng)時(shí)間，通過(guò)摸索達(dá)到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。
3. 適當(dāng)延長(zhǎng) TUNEL 反應(yīng)液的時(shí)間。
一般是37oC 二氧化碳培養(yǎng)箱1h，也可以根據(jù)凋亡損傷程度，選擇更長(zhǎng)的時(shí)間，可長(zhǎng)至 2h，但要結(jié)合最終的背景著色。
4. DAB 顯色條件的選擇。
一般 DAB 反應(yīng)10 min左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色，最長(zhǎng)不超過(guò) 30min。
5. PBS 的充分清洗。
在 TUNEL 反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格，可增加次數(shù)達(dá) 5次，因?yàn)檫@些清洗直接決定最后切片的非特異性著色。
6. 此外，內(nèi)源性 POD 的封閉也十分關(guān)鍵。
對(duì)于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間和升高過(guò)氧化氫的濃度，可以達(dá)到很好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。
細(xì)胞通透的時(shí)間選擇
1.蛋白酶 k 的目的是通透細(xì)胞膜和核膜，從而使反應(yīng)試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高陽(yáng)性率。但濃度過(guò)高或孵育時(shí)間太長(zhǎng)容易脫片，只要不脫片，影響不大，其作用類(lèi)似與 TritonX100 等細(xì)胞通透劑。
2. 蛋白酶K一般工作液濃度為 20 μg/ml,但濃縮液可配制1-10mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分裝成小份，用完一支再用下一支，-20oC保存 1 個(gè)月應(yīng)該沒(méi)問(wèn)題的（重復(fù)拿的那支），而一直冷凍的至少可以用半年以上。
3. 蛋白酶K反應(yīng)時(shí)間一般為10-30min，具體時(shí)間長(zhǎng)短與切片厚薄有關(guān)，4μm左右的片子可以用10min，但30μm左右的可用30 min，最終通過(guò)摸索最佳時(shí)間。過(guò)長(zhǎng)易脫片、過(guò)短起不到通透效果。
關(guān)鍵試劑操作條件：DAB 顯色反應(yīng)大約需要10min，要控制好反應(yīng)時(shí)間，勿使背景顏色過(guò)深。具體的可能還是得根據(jù)切片組織來(lái)源和切片厚度、試劑盒種類(lèi)不同來(lái)摸索一下；蛋白酶K工作液處理時(shí)間、溫度須在范圍內(nèi)摸索，溫度過(guò)高，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易破壞核酸結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)假陽(yáng)性；DNase1一般室溫，10min即可。
如何減弱非特異性染色
若是肝臟或腎臟，因富含內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，需要增加過(guò)氧化氫濃度和延長(zhǎng)孵育時(shí)間。其他還可以加強(qiáng)滅活、縮短 DAB 孵育時(shí)間、PBS 充分清洗，注意鏡下把握好著色。
Tips:
1.濕盒用帶蓋方盤(pán)，里面固定幾根玻璃吸管用于放玻片，使用時(shí)稍加水即可。
2.英文說(shuō)明書(shū)中對(duì)組織細(xì)胞通透這一步中，加了“對(duì)難處理的組織的處理”，意思是用常規(guī)方法處理（如蛋白酶 K)后，應(yīng)該陽(yáng)性而做不出陽(yáng)性時(shí)，可用微波修復(fù)。
3.復(fù)染的目的是為了襯托組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，以利于結(jié)果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。
4.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配制，加蒸餾水稀釋后即可用。
5.蛋白酶 K 消化蛋白后，需要用封閉液。