五分鐘了解如何通過(guò)盤古qPCR儀進(jìn)行KASP基因分型檢測(cè)

什么是KASP

KASP (kompetitive allele specific PCR，競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 是一種基于單核苷酸多態(tài)性(SNP) 的新型基因分型技術(shù)。該技術(shù)基于PCR 反應(yīng)結(jié)束后的熒光讀取，每孔采用雙色熒光檢測(cè)一個(gè)樣本一個(gè)位點(diǎn)可能的兩種基因型，是目前高效和經(jīng)濟(jì)的基因分型手段之一。下面我們來(lái)看看如何通過(guò)盤古qPCR儀進(jìn)行KASP基因分型檢測(cè)。

KASP 工作流程

step  one：

設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的探針與引物，引物一共是三條，兩條帶有熒光接頭的分型上游及一條通用下游（下圖A）。探針一共是四條，兩條熒光探針和兩條淬滅探針（下圖B），熒光探針與淬滅探針是互補(bǔ)的，且熒光探針是與特異性上游引物的接頭部分序列(tag sequence)一致。

step  two：

通過(guò)qPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在首輪PCR擴(kuò)增中，等位基因特異引物(3'末端能配對(duì)的)就可識(shí)別特定等位基因模板，完成等位基因識(shí)別，反向通用引物也會(huì)結(jié)合并完成整個(gè)PCR過(guò)程，在此階段，熒光標(biāo)記的探針仍與其互補(bǔ)的淬滅探針結(jié)合，并且不會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)。從第二輪PCR擴(kuò)增開始，產(chǎn)物中出現(xiàn)攜帶通用標(biāo)簽序列(tag sequence)的模板，這步完成把通用標(biāo)簽序列引入與SNP對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物中。隨后攜帶熒光的探針通過(guò)與tag互補(bǔ)的DNA鏈結(jié)合而添加到PCR產(chǎn)物中，因此不再與其互補(bǔ)的淬滅探針結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。

PCR過(guò)程中如何保證探針和引物都能按照預(yù)期進(jìn)行結(jié)合呢?

因?yàn)樵O(shè)置了降落PCR的程序，可以保證探針及引物的分開結(jié)合。當(dāng)退火溫度高時(shí)，引物因?yàn)?span>Tm值高，會(huì)先與模板進(jìn)行特異性的結(jié)合，然后在Taq酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增，從而增加探針擴(kuò)增的原始模板。隨著退火溫度降低，探針開始結(jié)合模板，然后產(chǎn)生熒光信號(hào)。

step  three：

盤古qPCR檢測(cè)運(yùn)行后，在SNP分析菜單下獲取KASP數(shù)據(jù)。

盤古快速熒光定量PCR系統(tǒng)助力KASP基因分型檢測(cè)

•升溫速度可達(dá)8.5℃/s，一次快速完成96個(gè)基因分型反應(yīng)并出具結(jié)果，產(chǎn)物得率高，特異性好

•溫控精度±0.1℃滿足KASP對(duì)擴(kuò)增溫度的嚴(yán)苛要求，確保識(shí)別單個(gè)堿基差異的特異性

•支持12列溫度梯度功能，便于快速優(yōu)化KASP擴(kuò)增所需條件

•光波導(dǎo)頂部檢測(cè)，無(wú)邊緣效應(yīng)和光程差，無(wú)需校準(zhǔn)

•6色檢測(cè)通道，支持各種常用熒光標(biāo)記，兼容常用KASP分型試劑盒

KASP應(yīng)用

KASP技術(shù)具有靈活、便宜、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，相比于其他技術(shù)，具有一定的靈活性，更容易實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化檢測(cè)。另外，KASP采用的是通用探針，可以與各種不同的基因特異引物配合使用，而不需要針對(duì)每個(gè)特定的位點(diǎn)進(jìn)行探針合成，這極大降低了實(shí)驗(yàn)的試劑成本。該技術(shù)目前已在動(dòng)植物育種、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和種子純度鑒定等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。