五分鐘了解如何通過盤古qPCR儀進行KASP基因分型檢測

什么是KASP

KASP (kompetitive allele specific PCR，競爭性等位基因特異性聚合酶鏈式反應) 是一種基于單核苷酸多態(tài)性(SNP) 的新型基因分型技術。該技術基于PCR 反應結束后的熒光讀取，每孔采用雙色熒光檢測一個樣本一個位點可能的兩種基因型，是目前高效和經(jīng)濟的基因分型手段之一。下面我們來看看如何通過盤古qPCR儀進行KASP基因分型檢測。

KASP 工作流程

step  one：

設計對應的探針與引物，引物一共是三條，兩條帶有熒光接頭的分型上游及一條通用下游（下圖A）。探針一共是四條，兩條熒光探針和兩條淬滅探針（下圖B），熒光探針與淬滅探針是互補的，且熒光探針是與特異性上游引物的接頭部分序列(tag sequence)一致。

step  two：

通過qPCR儀進行PCR擴增。在首輪PCR擴增中，等位基因特異引物(3'末端能配對的)就可識別特定等位基因模板，完成等位基因識別，反向通用引物也會結合并完成整個PCR過程，在此階段，熒光標記的探針仍與其互補的淬滅探針結合，并且不會產(chǎn)生熒光信號。從第二輪PCR擴增開始，產(chǎn)物中出現(xiàn)攜帶通用標簽序列(tag sequence)的模板，這步完成把通用標簽序列引入與SNP對應的PCR產(chǎn)物中。隨后攜帶熒光的探針通過與tag互補的DNA鏈結合而添加到PCR產(chǎn)物中，因此不再與其互補的淬滅探針結合，從而產(chǎn)生熒光信號。

PCR過程中如何保證探針和引物都能按照預期進行結合呢?

因為設置了降落PCR的程序，可以保證探針及引物的分開結合。當退火溫度高時，引物因為Tm值高，會先與模板進行特異性的結合，然后在Taq酶作用下進行擴增，從而增加探針擴增的原始模板。隨著退火溫度降低，探針開始結合模板，然后產(chǎn)生熒光信號。

step  three：

盤古qPCR檢測運行后，在SNP分析菜單下獲取KASP數(shù)據(jù)。

盤古快速熒光定量PCR系統(tǒng)助力KASP基因分型檢測

•升溫速度可達8.5℃/s，一次快速完成96個基因分型反應并出具結果，產(chǎn)物得率高，特異性好

•溫控精度±0.1℃滿足KASP對擴增溫度的嚴苛要求，確保識別單個堿基差異的特異性

•支持12列溫度梯度功能，便于快速優(yōu)化KASP擴增所需條件

•光波導頂部檢測，無邊緣效應和光程差，無需校準

•6色檢測通道，支持各種常用熒光標記，兼容常用KASP分型試劑盒

KASP應用

KASP技術具有靈活、便宜、準確等特點，相比于其他技術，具有一定的靈活性，更容易實現(xiàn)高通量和自動化檢測。另外，KASP采用的是通用探針，可以與各種不同的基因特異引物配合使用，而不需要針對每個特定的位點進行探針合成，這極大降低了實驗的試劑成本。該技術目前已在動植物育種、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構建和種子純度鑒定等領域得到了廣泛的應用。