Western Blotting老踩坑？一篇搞定常見問題

 洗滌不充分

 ● 增加洗滌次數(shù)

 ● 增加洗液體積

 ● 延長(zhǎng)洗滌時(shí)間

 ● 確認(rèn)Tween^® 20 (*)濃度

 無法阻斷非特異性結(jié)合

 ● 重新調(diào)節(jié)封閉溫度和時(shí)間。室溫下1 h，4℃下過夜

 ● 添加Tween^® 20 (*)

 ● 使用添加Tween^® 20 (*)的封閉緩沖液（TBS-T、PBS-T）

 ● 使用高靈敏度發(fā)光試劑（Immunostar^® 系列）

 膜處理不當(dāng)

 ● 對(duì)膜進(jìn)行必要的前處理

 ● 使用干凈的鑷子和手套，注意不要損壞膜。

 ● 孵育時(shí)振蕩

 ● 使用低背景且可高靈敏度檢測(cè)靶蛋白的CLEARTRANS^® 系列產(chǎn)品

 因設(shè)備、器皿的污垢造成的污染

 ● 充分清洗轉(zhuǎn)膜裝置、電泳槽等設(shè)備，操作過程中佩戴手套

 強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號(hào)

 ● 縮短檢測(cè)的曝光時(shí)間

 ● 縮短檢測(cè)試劑的反應(yīng)時(shí)間

 ● 降低檢測(cè)試劑的濃度

 電壓過高發(fā)熱

 ● 降低電壓進(jìn)行電泳

 鹽濃度不同

 ● 鹽濃度越高，移動(dòng)速度越快，需統(tǒng)一樣品的鹽濃度

 上樣量不同

 ● 統(tǒng)一各個(gè)孔的上樣量

 有空孔

 ● 在空孔中上樣相同鹽濃度、相同液量的樣品，或僅上樣樣品緩沖液

 樣品存放時(shí)間久，存儲(chǔ)方法不當(dāng)，

導(dǎo)致蛋白降解

 凝膠和膜之間有氣泡

 ● 使用滾筒等去除氣泡

 轉(zhuǎn)膜設(shè)備的問題

 ● 使用半干式設(shè)備時(shí)，反復(fù)使用會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜板彎曲，建議返廠維修或更換

    新的設(shè)備

 轉(zhuǎn)膜方法的問題

 ● 半干式設(shè)備容易引起轉(zhuǎn)膜不均勻的問題，可嘗試更換為濕轉(zhuǎn)儀

 蛋白量過高

 ● 降低電泳的蛋白量

 抗體濃度高

 ● 降低一抗、二抗的濃度

 檢測(cè)信號(hào)高

 ● 縮短曝光時(shí)間

 ● 縮短檢測(cè)試劑的反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)后盡可能去除試劑

 ● 降低二抗?jié)舛?/span>

 蛋白量高

 ● 減少蛋白量

 抗體濃度高

 ● 降低一抗、二抗的濃度

 抗體失活

 ● 檢查抗體存儲(chǔ)狀態(tài)，時(shí)間

 ● 重新進(jìn)行抗體反應(yīng)時(shí)，推薦使用10 min即可去除抗體的“WB膜再生液“

 抗體結(jié)合力不足

 ● 確認(rèn)抗體的稀釋濃度是否合適

 ● 延長(zhǎng)抗體反應(yīng)時(shí)間

 ● 對(duì)于低蛋白表達(dá)量的樣品，可增加電泳量，提高抗體濃度

 ● 使用抗原抗體反應(yīng)促進(jìn)試劑

 ● 更換高效轉(zhuǎn)膜緩沖液

 疊氮-化鈉抑制酶反應(yīng)

 ● 疊氮-化鈉會(huì)抑制HRP的活性，因此抗體中含疊氮-化鈉時(shí)，需要稀釋抗體

   以降低疊氮-化鈉濃度或使用不含疊氮-化鈉的抗體

 ● 使用HRP標(biāo)記一抗且阻斷劑中含有疊氮-化鈉時(shí)，需在封閉后使用 TBS-T

   清洗再進(jìn)行抗體反應(yīng)

 曝光時(shí)間短

 ● 延長(zhǎng)曝光時(shí)間

 封閉時(shí)間不當(dāng)

 ● 封閉時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，封閉劑會(huì)遮蓋抗原，降低抗體反應(yīng)性，因此需要確認(rèn)封

   閉時(shí)間是否合適

 轉(zhuǎn)膜效率低，無法轉(zhuǎn)膜

 ● 延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間

 ● 靶蛋白的分子量較高時(shí)(例：100   kD以上)，添加0.1%的SDS(十二烷基硫

   酸鈉)

● 使用預(yù)染蛋白Marker作為陽性對(duì)照，確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效率

 ● 使用具有抗體結(jié)合位點(diǎn)的分子量Marker作為陽性對(duì)照

 檢測(cè)試劑的化學(xué)發(fā)光弱

 ● 確認(rèn)檢測(cè)試劑是否變質(zhì)

 ● 使用高靈敏度的發(fā)光試劑“ImmunoStar^®系列“

 鑷子被污染

 ● 鑷子上的污垢會(huì)附著在膜上形成背景。需使用經(jīng)乙醇消毒后的干凈鑷子

   夾住膜的邊緣

 洗滌不充分

● 增加洗滌次數(shù)和洗液體積

 抗體反應(yīng)不當(dāng)

 ● 增加抗體反應(yīng)溶液，并振蕩使其反應(yīng)

 檢測(cè)設(shè)備被污染

● 檢測(cè)前，使用乙醇擦拭放置膜的樣品臺(tái)，去除污垢

 蛋白未轉(zhuǎn)膜

 ● 確認(rèn)轉(zhuǎn)膜設(shè)備是否正確運(yùn)行

 ● 確認(rèn)膜和凝膠是否正確接觸

 低蛋白量

● 增加蛋白的上樣量

 染色試劑變質(zhì)

 ● 檢查染色試劑的有效期

 ● 更換凝膠染色試劑（Negative Gel Stain MS Kit、Ponceau 3R、

   Ponceau-3R StainSolution、Amido Black 10B）