CEM Discover 高效準(zhǔn)備嬰兒配方中氨基酸的分析

創(chuàng)制具有理想營(yíng)養(yǎng)剖面的嬰兒配方奶粉是至關(guān)重要的。對(duì)于用配方奶粉喂養(yǎng)的寶寶來(lái)說(shuō)，嬰兒配方奶粉通常是他們出生后六個(gè)月內(nèi)的主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。嬰兒配方奶粉的目標(biāo)是盡可能接近母乳的成分。對(duì)于對(duì)母乳過(guò)敏的嬰兒來(lái)說(shuō)，配方奶粉尤為重要，因?yàn)樗赡苁撬麄兛邛恳坏臓I(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而且配方必須不含過(guò)敏原。

美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）規(guī)定了嬰兒配方奶粉中 29 種不同營(yíng)養(yǎng)素的蕞低含量，包括蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及維生素等微量營(yíng)養(yǎng)素。其中一些營(yíng)養(yǎng)素，如蛋白質(zhì)，也有最高含量的限制。嬰兒配方奶粉中的蛋白質(zhì)含量高于母乳，這引起了關(guān)于其如何影響嬰幼兒成長(zhǎng)的研究仍在進(jìn)行中，但這凸顯了了解嬰兒配方奶粉中蛋白質(zhì)水平的重要性。

當(dāng)檢查結(jié)果時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) Discover Prep 得出的嬰兒配方奶粉水解物的結(jié)果與傳統(tǒng)方法測(cè)定的結(jié)果相似，且具有出色的重復(fù)性。Discover Prep 相比傳統(tǒng)方法有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，例如快速的壓縮空氣冷卻和易用性，其介電微波加熱機(jī)制提供了即時(shí)和均勻的體積加熱，有助于加速水解過(guò)程，而不損害回收率或精確度。

02 材料與方法????

試劑和樣本

本研究中使用的所有試劑均購(gòu)自矢口名的商業(yè)供應(yīng)商。本研究采用了美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）的嬰兒配方奶粉標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)（SRM）。為了重組嬰兒配方奶粉，將 1 克的嬰兒配方奶粉與 9 毫升的水混合。水解溶液在使用前被新鮮制備，以確保最佳新鮮度和效果。

嬰兒配方奶粉樣本使用 CEM Discover Prep 系統(tǒng)進(jìn)行水解。隨后，通過(guò)柱前衍生化過(guò)程確定了水解物中的氨基酸含量，接著進(jìn)行超高效液相色譜（UPLC）注射和在 260 nm 波長(zhǎng)下的光電二極管陣列（PDA）檢測(cè)。對(duì)于水解物的液相色譜-光電二極管陣列（LC-PDA）分析，使用了 Waters AccQ-Tag Ultra 衍生化試劑盒。使用 Discover Prep 樣本制備得到的結(jié)果與傳統(tǒng)烘箱方法以及相應(yīng)的分析證書(shū)（CofA）中的信息進(jìn)行了比較，以衡量準(zhǔn)確性和效率。

Discover Prep 水解方法在利用 Discover Prep 進(jìn)行的水解過(guò)程中，將 750 µL 的重組嬰兒配方奶粉樣本轉(zhuǎn)移到一個(gè) 35-mL 的 Pyrex 玻璃瓶中，然后安裝攪拌棒。記錄樣品的精確質(zhì)量以供后續(xù)分析。接下來(lái)，向每個(gè)微波反應(yīng)瓶中加入 5 mL 含有 1% 苯酚的 6 N 鹽酸（HCl）。為了最小化氧化，瓶子被氮?dú)猓∟₂）沖洗 60 秒，之后迅速用 Teflon^® 襯里的硅膠蓋密封，并放置在樣品架上，隨后放入 Discover Prep 的腔體中。為了確?？煽啃院蜏?zhǔn)確性，樣品進(jìn)行了三次重復(fù)分析。為嬰兒配方奶粉的氨基酸水解專門(mén)配置了一步到位的動(dòng)態(tài)方法。精心編程到 Discover Prep 中的該方法參數(shù)包括：

酸性水解

瓶型：Pyrex

控制類型：動(dòng)態(tài)

溫度：160 °C

時(shí)間：20分鐘

壓力：300 PSI

功率：300 W

攪拌：高

樣品制備和衍生化分析

所有水解后的溶液都使用 0.2 µm PTFE 過(guò)濾器仔細(xì)過(guò)濾，以去除任何顆粒物質(zhì)。然后，通過(guò)用 6 M NaOH 中和溶液來(lái)調(diào)整 pH 值，為衍生化作準(zhǔn)備。根據(jù) Waters AccQ-Tag Ultra 衍生化試劑盒的協(xié)議，將 80 µL 的硼酸緩沖液加入扌旨定的回收瓶中。接著加入 10 µL 的水解物樣品。然后密封瓶子，并使用渦旋混合器彳切底混合內(nèi)容物以確保均勻性。下一步是將 10 µL 預(yù)先準(zhǔn)備好的衍生化試劑從試劑盒加入到每個(gè)樣品反應(yīng)瓶中。在加入衍生化試劑后，再次將混合物渦旋 10 秒鐘以確保完荃反應(yīng)。最后，將樣品在 55 °C 下加熱 10 分鐘以促進(jìn)衍生化過(guò)程，然后進(jìn)行解析測(cè)定。

分析

每個(gè)衍生反應(yīng)的 1 µL 樣本被精確地注射到 Waters AccQ-Tag Ultra C18 柱（1.7 µm, 2.1 x 100 mm）上，該柱與裝備了 Waters PDA 檢測(cè)器的 Waters ACQUITY H-Class™ UPLC 系統(tǒng)相連。色譜分析在控制的流速 0.4 mL/min 下進(jìn)行。通過(guò)將柱溫保持在 55 °C 來(lái)實(shí)現(xiàn)最佳分離，并在 260 nm 波長(zhǎng)下仔細(xì)監(jiān)測(cè)吸光度。為高效分離而量身定制的洗脫梯度詳見(jiàn)表1。使用的流動(dòng)相是A：在 MilliQ 水中稀釋了 10 倍的 Waters AccQ-Tag 洗脫液A和B：Waters AccQ-Tag 洗脫液 B。為了為每種氨基酸建立校準(zhǔn)曲線，使用濃度為1、5、10、25、50、100 和 200 pmol/µL 的 Waters 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)（Waters 公司，零件號(hào) WAT088122）進(jìn)行衍生化。線性回歸用作樣品定量評(píng)估的分析工具。

表1. 用于衍生化氨基酸分離的梯度

圖1. Discover Prep 數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)氨基酸水解和 SRM 分析證書(shū)（CofA）的比較

04 結(jié)論

1.Food and Drug Administration. The Office of the Federal Register (OFR) of the National Archives and Records Administration (NARA), and the U.S. Government Publishing Office (GPO). 21 CFR 107. Infant Formula: The Addition of Minimum and Maximum Levels of Selenium to Infant Formula and Related Labeling Requirements.

2.Bo L?nnerdal. Infant Formula and Infant Nutrition: Bioactive Proteins of Human Milk and Implications for Composition of Infant Formulas. The American Journal of Clinical Nutrition,Volume 99, Issue 3. [Online]2014,712S–717S.

注：AccQ-Tag™ 和 ACQUITY H-Class™ 是 Waters 公司的商標(biāo)。Teflon^® 是Chemours（正式名稱為 DuPont）擁有的注冊(cè)商標(biāo)和品牌名稱。Discover Prep™ 是 CEM 公司的商標(biāo)。