新版指南解讀 | TBNK性能驗證及室內(nèi)質(zhì)控怎么做？

散射光靈敏度：采用已知大小的校準微球檢測儀器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散點圖上，應(yīng)檢測出直徑0.5mm 或更小的微球，或滿足儀器出廠聲明的要求。

熒光靈敏度：流式細胞儀能檢測到標準熒光微球上的最少熒光分子數(shù)， 可用MESF表示，常用熒光通道應(yīng)為FITC≤ 200 MESF、PE≤100 MESF 、APC≤200 MESF，或滿足儀器出廠聲明的要求。

以8峰微球檢測MESF舉例，每個熒光通道獲取8峰微球的MFI，根據(jù)微球說明書提供的軟件，計算相對應(yīng)熒光通道的MESF。

散射光分辨率：采用EDTA鹽或肝素抗凝全血，取適量樣品稀釋后直接上機測定，標本在FSC/SSC散點圖可將紅細胞和血小板清晰地區(qū)分開；取適量樣品裂解紅細胞后上機測定，標本在FSC/SSC散點圖可將淋巴細胞、單核細胞、粒細胞清晰地區(qū)分開，即認為散射光分辨率符合要求。

熒光通道分辨率：采用校準微球上機測定，各熒光通道的分辨率CV值應(yīng)符合制造商聲明的要求。

可采用含有不同熒光強度的校準微球（已知其相應(yīng)熒光素的MESF）進行檢測，計算每 一種熒光微球的MFI，以MEFL數(shù)（y）和平均熒光強度（x）的線性回歸，計算相關(guān)系數(shù)（r）。相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.98，此方法適用于校準微球上的熒光素可被定量檢測的熒光通道。

以FITC/PE通道8峰微球舉例

將標準微球充分混勻后上機進行試驗，測試完成后利用直方圖分析實驗結(jié)果，計算標準微球的平均熒光強度FL1，連續(xù)8小時開機后，再通道條件下重復(fù)檢測，得到標準微球的平均熒光強度FL2，根據(jù)兩次檢測結(jié)果計算偏差，公式見下，每一通道的平均熒光強度變化范圍均應(yīng)在基線值±10%范圍內(nèi)。

使用濃度為5000個/µL～10000個/µL的校準微球上機進行測定，獲取至少100000個顆粒，連續(xù)測定3 次，計算檢測通道內(nèi)設(shè)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為H1、H2、H3；再使用空白溶液上機測定，獲取顆粒30s，連續(xù)測試3次，計算該檢測通道內(nèi)設(shè)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為L1、L2、L3。按照此步驟重復(fù)循環(huán)3 次。

取上述公式計算最大值。攜帶污染率應(yīng)≤0.5％。

批內(nèi)精密度：選取至少5個新鮮全血樣品，樣品的淋巴細胞亞群細胞計數(shù)應(yīng)覆蓋低中高水平。每個標品從熒光染 色到上機檢測重復(fù)3次，并確保所有測試都在同一臺儀器的同一批內(nèi)測定，整個操作過程由同一個操作 人員完成。先計算每個樣品重復(fù)3次后檢測結(jié)果的CV,然后計算所有樣品的平均CV，所有樣品的平均CV 宜＜10％，最大不超過20％。實驗室可根據(jù)不同水平的淋巴細胞亞群細胞計數(shù)設(shè)定不同程度的可接受CV 標準。

日間精密度：宜使用正常和異常兩個濃度水平的全血質(zhì)控品，每天從熒光染色到上機測定重復(fù)操作3次， 至少重 復(fù)4天，整個操作過程可由不同操作人員完成。先計算每天每個全血質(zhì)控品重復(fù)3次檢測結(jié)果的CV值，然 后據(jù)此計算每個全血質(zhì)控品4天的平均CV，最后得出兩個全血質(zhì)控品檢測結(jié)果的平均CV。判定標準同上。

樣品穩(wěn)定性：驗證樣品在確定的抗凝及處置條件下的穩(wěn)定性。采集健康人或患者的樣品至少 5 份，即刻染色-裂 解-固定并上機測定，以此結(jié)果作為基線參考水平，按照實驗室的具體環(huán)境溫度控制條件和預(yù)期的樣品待檢時間，在抗凝劑保存時間內(nèi)，設(shè)置不同的時間點對上述樣品進行重復(fù)處理和上機測定，獲取檢測結(jié)果，并與基線水平結(jié)果進行比較，以相對偏差或絕對偏差表示，檢測結(jié)果應(yīng)符合實驗室制定的驗證要求。淋巴細胞亞群計數(shù)過低者，宜以絕對偏差進行驗證；亦可對試劑說明書聲明的穩(wěn)定性條件進行驗證。

處理后標本穩(wěn)定性：旨在明確處理后標本的最長待檢時間。采集健康人或患者的樣品至少5份，對完成染色-裂解-固定 后的標本即刻上機檢測結(jié)果作為基線水平。按實驗室獲得檢測結(jié)果的最長可接受時間為期限，設(shè)置不同 的時間點對固定后標本進行上機檢測。結(jié)果判定同上一條。亦可對試劑說明書聲明的穩(wěn) 定性條件進行驗證。

適用于淋巴細胞亞群絕對細胞計數(shù)。根據(jù)試劑說明書聲明的線性范圍，取一份淋巴細胞計數(shù)或亞群 計數(shù)接近線性范圍上限的臨床樣品，采用樣品稀釋液按照比例制備 5～9 個不同濃度的標本，濃度范圍應(yīng)覆蓋臨床醫(yī)學決定水平；通過染色-裂解-固定后，上機測定， 每個標本重復(fù)測定 4 次，取均值。分析實際測定的亞群細胞數(shù)量均值與理論值之間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù) r 應(yīng)≥0.975。

抗體試劑批次變更前后的可比性驗證：宜使用至少3份健康人的新鮮全血樣品和2份不同濃度質(zhì)控品，采用新批號抗體試劑和當前批號抗體 試劑進行熒光染色、上機檢測，以當前批號試劑檢測結(jié)果為參考，計算相對偏差或絕對偏差。檢測結(jié)果 應(yīng)符合實驗室制定的驗證要求。驗證要求的制定應(yīng)考慮不同水平的淋巴細胞亞群計數(shù)設(shè)定不同程度的偏 差值，淋巴細胞亞群計數(shù)過低者，宜以絕對偏差進行驗證。

不同檢測系統(tǒng)間的可比性驗證：宜使用至少 5 份新鮮全血樣品（樣品的淋巴細胞亞群細胞計數(shù)應(yīng)覆蓋低中高水平）和 2 份不同濃度 水平的全血質(zhì)控品，完成染色-裂解-固定后，分別采用待評價檢測系統(tǒng)和比對檢測系統(tǒng)進行檢測。比對 檢測系統(tǒng)應(yīng)為儀器性能良好、規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價成績合格的淋巴細胞亞群常規(guī)檢測 系統(tǒng)，以比對檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果為參考，計算相對偏差或絕對偏差。檢測結(jié)果應(yīng)符合實驗室制定的驗 證要求。驗證要求的制定應(yīng)考慮不同水平的淋巴細胞亞群計數(shù)設(shè)定不同程度的偏差值，淋巴細胞亞群計 數(shù)過低者，宜以絕對偏差進行驗證。

不同檢測人員間的可比性驗證：宜使用至少5份新鮮全血樣品和2份不同濃度水平的全血質(zhì)控品，分別由實驗室內(nèi)淋巴細胞亞群檢測 培訓(xùn)合格的不同檢測人員完成染色-裂解-固定、上機檢測和數(shù)據(jù)分析，計算不同檢測人員間檢測結(jié)果的 相對偏差或絕對偏差。驗證結(jié)果應(yīng)符合實驗室制定的驗證要求。

可使用室間質(zhì)評回報結(jié)果驗證淋巴細胞亞群項目的準確度。

應(yīng)選擇商品化全血質(zhì)控品進行室內(nèi)質(zhì)控，并至少包括兩個濃度水平，CD4+T細胞的絕對細胞計數(shù)應(yīng)包括低值濃度水平質(zhì)控。

檢測當日至少做一次質(zhì)控，質(zhì)控品應(yīng)和患者樣品同時進行免疫熒光染色，并在患者標本檢測前進行上機測定和數(shù)據(jù)分析。檢測完成后做好相應(yīng)質(zhì)控記錄。

應(yīng)至少選擇1_3S和2_2S作為失控判斷標準，應(yīng)有相應(yīng)的失控糾正措施。

以CD3+T細胞質(zhì)控曲線舉例

隨著TBNK項目開展的普及，結(jié)果的準確與患者免疫狀態(tài)的評估和治療方案的制訂是否能夠正常進行的前提與保障。因此TBNK室內(nèi)質(zhì)控尤為重要，可以確保TBNK檢測結(jié)果的準確性和可靠性。