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一種先進(jìn)的用于高細(xì)胞濃度灌流培養(yǎng)的聲學(xué)截留系統(tǒng)-BioSep
哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對于生物技術(shù)行業(yè)的蛋白質(zhì)生產(chǎn)具有重要意義[1]。制藥行業(yè)中約70%的重組蛋白是使用中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）生產(chǎn)的。
在灌流培養(yǎng)中，營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)供應(yīng)并去除副產(chǎn)物[2]。與批培養(yǎng)和流加補(bǔ)料技術(shù)相比，灌流為細(xì)胞提供了有利的環(huán)境和較短的產(chǎn)品停留時(shí)間。這對于不穩(wěn)定產(chǎn)品的質(zhì)量尤為重要。灌流模式的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它允許使用較小的生物反應(yīng)器并減少在位清洗操作[3]。
灌流需要一種裝置將細(xì)胞保留在培養(yǎng)基中。灌流中使用的大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞保留系統(tǒng)都基于細(xì)胞尺寸差異，例如使用濾器。然而，由于濾器不可避免的污染，傳統(tǒng)的過濾膜無法實(shí)現(xiàn)真正的穩(wěn)態(tài)灌流培養(yǎng)。此外，頻繁更換過濾器會(huì)增加成本和污染風(fēng)險(xiǎn)[4]。
聲學(xué)分離器是一種替代的細(xì)胞截留系統(tǒng)，利用超聲波駐波場中產(chǎn)生的力將細(xì)胞與清液分離。細(xì)胞被困在駐波的壓力平面中，并收集為松散的聚集體。這些細(xì)胞聚集體通過重力沉降返回生物反應(yīng)器[4]。
在本研究中，使用了一種針對高密度細(xì)胞培養(yǎng)物灌流的Applikon Biosep 10 L聲學(xué)細(xì)胞分離器的高級版本。生物反應(yīng)器中，細(xì)胞密度在11~144*106 cells/mL之間的CHO細(xì)胞評估其性能。
材料和方法
細(xì)胞聲學(xué)截留裝置 – BioSep
BioSep 系統(tǒng)由聲學(xué)腔室和控制器組成。
控制器功能是自動(dòng)產(chǎn)生聲學(xué)腔室內(nèi)的聲場。
來自生物反應(yīng)器的細(xì)胞懸液被泵輸入到安裝在生物反應(yīng)器頭板上的聲學(xué)腔室中。
駐波迫使懸浮細(xì)胞進(jìn)入平面，在那里它們形成松散的聚集體（圖 1）。
清液向上通過聲場而收獲，而濃縮的細(xì)胞則返回到生物反應(yīng)器。
隨著細(xì)胞濃度和灌流速率的增加，聲學(xué)腔室的功率輸入被調(diào)整到更高水平，以保持高分離效率[5]。
運(yùn)行時(shí)間對應(yīng)于細(xì)胞與清液分離的時(shí)間段。在運(yùn)行時(shí)間結(jié)束時(shí)，聲場暫時(shí)關(guān)閉，收獲暫停，同時(shí)腔室中的細(xì)胞返回生物反應(yīng)器。
在這項(xiàng)研究中，功率水平和運(yùn)行時(shí)間發(fā)生了變化，以獲得最佳設(shè)置，使高密度CHO 細(xì)胞培養(yǎng)超過 125* 106 cells/mL。
實(shí)驗(yàn)裝置
為了評估在一系列高細(xì)胞濃度下的分離性能，將CHO 細(xì)胞在搖瓶中培養(yǎng)，濃縮、然后懸浮在使用my-Control 操作系統(tǒng)的Applikon 250 mL MiniBio 生物反應(yīng)器中。
BioSep 10 L的功率水平為2~7W。
實(shí)驗(yàn)設(shè)置如圖2所示。
2丨
A） 實(shí)驗(yàn)裝置包括：進(jìn)料罐、廢液罐、收獲泵、進(jìn)料泵、聲學(xué)室、MiniBio 250 mL、my-Control
B）典型的實(shí)驗(yàn)裝置[5]
3 | 分析方法
•BioSep 的分離效率根據(jù)公式 1 計(jì)算:
SE (%) = 1 - HX / BX *100 [1]
其中HX對應(yīng)于收獲管路的活細(xì)胞濃度，BX對應(yīng)于生物反應(yīng)器中的活細(xì)胞濃度[4]。
為確保穩(wěn)定和可重復(fù)的聲學(xué)條件，在從收獲管路和生物反應(yīng)器取樣之前，超聲波功率輸入、收獲速率和運(yùn)行/反沖洗定時(shí)器設(shè)置至少恒定 30 分鐘。
根據(jù)所選運(yùn)行周期的持續(xù)時(shí)間，在時(shí)間點(diǎn)采集收獲樣本，以獲得一致且可比較的數(shù)據(jù)(表1）。
結(jié)果和討論
1| 循環(huán)流速
在高細(xì)胞密度的灌流培養(yǎng)過程中，需要高循環(huán)速率，這會(huì)導(dǎo)致聲學(xué)室內(nèi)的湍流增加。
這種湍流誘導(dǎo)會(huì)影響聲學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集[6]。
在目前的研究中觀察到新的BioSep版本允許聲學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞聚集體不受干擾地沉降，最大流入速率高達(dá)7 mL/min（~10 L/天），允許保留超過100*106cells/mL的生物反應(yīng)器濃度。
2| 分離性能
從收獲管路和生物反應(yīng)器中采集的70對樣品中測定分離效率。
CHO細(xì)胞總濃度范圍為11~144*106 cells/mL。
研究了1~15L/天的不同凈收獲率、2~7 W的功率水平和2至10分鐘的運(yùn)行時(shí)間（未顯示值），結(jié)果總結(jié)在圖3中。
從圖3中可以看出，當(dāng)CHO細(xì)胞總濃度為100*106cells/mL時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)高達(dá)3L/天的凈收獲率，同時(shí)保持98%的典型活細(xì)胞分離效率。超過4L/天的凈收獲率會(huì)影響最高密度下的效率，但分離仍保留了90%以上的細(xì)胞。
在總濃度為125*106 cells/mL時(shí)，以2L/天的凈收獲率運(yùn)行，細(xì)胞分離效率達(dá)到98%。
在細(xì)胞濃度增加或收獲率高的情況下，使用高功率水平和更短的運(yùn)行周期是必要的[5]。
優(yōu)化功率（w）和運(yùn)行時(shí)間（min）的配對，以實(shí)現(xiàn)高密度細(xì)胞。這些值的組合使得最高的分離效率是：2 w - 10 min;3 W - 5 min;5 W - 3 min;7 W - 2 min。
這些結(jié)果是意料之中的，因?yàn)楦叩墓β仕皆试S在高濃度或高流量條件下增加細(xì)胞的保留，而更短的運(yùn)行時(shí)間避免了細(xì)胞聚集體在聲室中過度積聚，然后才有機(jī)會(huì)沉降回到生物反應(yīng)器。
Figure 3 分離效率以黑色方塊表示，作為記錄的流入管線的凈收獲率和CHO細(xì)胞總濃度的函數(shù)。功率水平矩陣表示在該特定凈收獲率下應(yīng)用的最大HF功率。黃色虛線表示循環(huán)速率20L/天和10L/天之間的邊界。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論
目前的研究證明了Biosep作為CHO細(xì)胞濃度高達(dá)125*106cells/mL的細(xì)胞保留系統(tǒng)，增強(qiáng)了細(xì)胞的沉降效率。在該細(xì)胞濃度下，以2 L/天的凈收獲率下運(yùn)行，分離效率高達(dá)98%。
參考文獻(xiàn)
[1]S. M. Woodside, B. D. Bowen, and J. M. Piret, “Mammalian cell retention devices for stirred perfusion bioreactors,” Cytotechnology, vol. 28, pp. 163–175, 1998.
[2]T. Kwon, N. Madziva, J. D. Oliveira, S. K. Chandramohan, L. Yin, H. Prentice, J. Han, ‘Long-term steady state perfusion culture of mammalian cells using a robust microfluidic cell retention device”. 19th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, 2015.
[3]M. F. Clincke, C. lleryd, Y. Zhang, E. Lindskog, K. Walsh, and V. Chotteau, “Very high density of CHO cells in perfusion by ATF or TFF in WAVE bioreactor. Part I: Effect of the cell density on the process,” Biotechnol. Prog., 2013.
[4]V. M. Gorenflo, J. B. Ritter, D. S. Aeschliman, H. Drouin, B. D. Bowen, and J. M. Piret, “Characterization and optimization of acoustic filter performance by experimental design methodology,” Biotechnol. Bioeng., 2005.
[5]Biosep manual 10 and 50 L per day, Applikon Biotechnology.
[6]I. Z. Shirgaonkar, S. Lanthier & A. Kamen, Acoustic cell filter: A proven cell retention technology for perfusion of animal cell cultures. Biotechnology Advances, 22(6), 433–444, 2004.
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