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樣品分析每一步都關(guān)鍵！用數(shù)據(jù)告訴你，如何擺脫步步驚心
樣品分析如何做到不要步步驚心，只要步步為營(yíng)？！讓小編用數(shù)據(jù)告訴你！
Q1 FASP（過(guò)濾輔助樣品制備，F(xiàn)ilter-Aided Sample Preparation）技術(shù)進(jìn)行蛋白分析前的濃縮、脫鹽或者去除未消解蛋白的回收率如何？
使用超濾管利用FASP技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽或者去除未消解蛋白的同時(shí)還能實(shí)現(xiàn)樣品的濃縮，因此比脫鹽柱更加的高效。同時(shí)超濾管的性價(jià)比更高，且可以同時(shí)處理幾十個(gè)樣品，因而廣泛受到青睞。那么使用超濾管的回收率如何？我們可以一起看一下劍橋大學(xué)的應(yīng)用數(shù)據(jù)：
劍橋大學(xué)的科學(xué)家在進(jìn)行胰島素A鏈肽段（MW 2.5kD）和降鈣素（MW 3,593 Da）研究時(shí)，采用Vivaspin® 500 3kD 的產(chǎn)品在13,000 rpm離心對(duì)它們進(jìn)行濃縮。盡管兩種蛋白的分子量很小，但回收率分別達(dá)到了98%和99%1。
Q2 HPLC分析，要實(shí)現(xiàn)無(wú)雜峰、低吸附，應(yīng)如何選擇針頭濾器來(lái)進(jìn)行澄清過(guò)濾？
應(yīng)選擇化學(xué)兼容性好的濾器，最好有HPLC Certificate。例如，Minisart® RC，它材質(zhì)純凈，化學(xué)兼容性好，既能過(guò)濾水系樣品又能過(guò)濾有機(jī)系的樣品。
再讓我們一起通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看看如何實(shí)現(xiàn)低吸附？
紅色熒光蛋白、阿達(dá)木和M12單抗、RuBisCO酶，這四種蛋白分子量相差較大，PI 介于6.6~8.4之間。吸附性研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為：分別對(duì)四種蛋白的濃度、體積、離子強(qiáng)度設(shè)定不同的水平并通過(guò)四種不同材質(zhì)的針頭濾器進(jìn)行過(guò)濾，共120個(gè)測(cè)定，來(lái)考察吸附情況2。
表1：對(duì)比四種蛋白過(guò)濾后吸附情況
結(jié)果顯示：
-
PES和CA材質(zhì)的濾器對(duì)幾種蛋白的吸附很小，是非常適合過(guò)濾蛋白樣品的濾器；而尼龍和PVDF的對(duì)蛋白吸附較高
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不同材質(zhì)的濾器對(duì)蛋白的吸附情況并未因蛋白不同而有明顯的不同
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不同pH主要通過(guò)影響蛋白的溶解度而影響其回收率
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：蛋白的吸附符合朗繆爾模型，回收率隨樣品量和濃度的增加而增加
Q3 濾膜過(guò)濾是否會(huì)向流動(dòng)相中釋放浸出物？
我們選擇了孔徑為0.2μm的兩種不同的賽多利斯濾膜材料，再生纖維素（RC，18407，批號(hào)1704923）和聚酰胺（尼龍，PA）（25007，批號(hào)1852193）。將所選過(guò)濾膜裝配于玻璃過(guò)濾器上（全玻璃真空過(guò)濾夾具，16309），通過(guò)過(guò)濾不同類型的溶液，來(lái)測(cè)試其在洗脫液過(guò)濾方面的性能。將所過(guò)濾的溶液用作洗脫液，使用HPLC-UV/VIS（純水和NaH2PO4緩沖液）和LC-HRMS（乙腈）進(jìn)行分析。此外，分析了純水經(jīng)再生纖維素RC膜或聚酰胺膜過(guò)濾后的TOC。實(shí)驗(yàn)對(duì)照為只經(jīng)過(guò)夾具未放置濾膜的樣品3。
圖1：純水和NaH2PO4緩沖液UV/VIS色譜圖
結(jié)果顯示：
該色譜圖顯示了RC膜非常低的色譜背景和低水平的污染物含量。而通過(guò)PA膜過(guò)濾的NaH2PO4洗脫液在梯度分離開(kāi)始時(shí)出現(xiàn)了一些峰，表明存在有機(jī)化合物，經(jīng)鑒定，這些化合物為聚酰胺低聚物。
圖2：用高分辨率質(zhì)譜法對(duì)兩種膜過(guò)濾所得的洗脫液進(jìn)行對(duì)比分析
結(jié)果顯示：
過(guò)濾的洗脫液和對(duì)照品的質(zhì)譜圖只有微小的差別。在ESI負(fù)電離模式下，兩種膜過(guò)濾液的譜圖相當(dāng)，與對(duì)照品一樣低。這相當(dāng)于常見(jiàn)溶劑背景信號(hào)。在ESI正電離模式下所得的乙腈濾液質(zhì)譜顯示了PA膜的一些小信號(hào)，這些信號(hào)可能歸屬為聚酰胺低聚物。這個(gè)結(jié)果與該過(guò)濾膜材料的TOC和HPLC-UV/VIS結(jié)果一致。
表2：TOC-V CSH分析結(jié)果
結(jié)果顯示：
對(duì)照品及兩種濾液的TOC值均在≤200ppb（ng/mL）范圍內(nèi)，說(shuō)明其有機(jī)污染物含量水平非常低。通過(guò)PA膜過(guò)濾后的濾液的TOC值稍高，說(shuō)明這些樣品中有機(jī)物的含量稍高。
基于這些結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：再生纖維素濾膜是洗脫液過(guò)濾的優(yōu)選，因?yàn)樗挠袡C(jī)化合物釋放量極低，并且與大多數(shù)溶劑都能很好地兼容。再生纖維素濾膜和聚酰胺濾膜均適用于在液相色譜分析中對(duì)水或有機(jī)流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)濾。只是建議在HPLC應(yīng)用中使用聚酰胺膜時(shí)，洗脫梯度的起始有機(jī)溶劑濃度應(yīng)設(shè)定的較高。
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-參考文獻(xiàn)-
1. Alan R. Johnson, Christine Turner
Anatomy Department, University of Cambridge, Downing Street, Cambridge, CB2 3DY. UK
Lab filtration Application note 2001
2.A. Croon, J. F. Buyel
Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Forckenbeckstraße 6, 52074 Aachen, Germany
How to Increase Recovery at Critical Protein Samples: Impact of Syringe Filter Membrane, Volume and pH
3.Klaus Schöne1, *, Stephanie Schweizer1, Tanja Verena Maier 2 ,*, Roberto Menzel 2
1. Sartorius Lab Instruments GmbH & Co.KG, Otto-Brenner-Str. 20, 37079 Göttingen, Germany
2. Sartorius Stedim Biotech GmbH, August-Spindler-Str. 11, 37079 Göttingen, Germany
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