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小鼠免疫球蛋白E(IgE)作為免疫反應(yīng)中的重要組成部分，在多種生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用中具有舉足輕重的地位。小鼠IgE試劑盒，特別是基于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)的試劑盒，已成為定量檢測(cè)小鼠血清、血漿及相關(guān)生物樣本中IgE含量的重要工具。本文將詳細(xì)介紹該試劑盒的操作步驟及需要注意的關(guān)鍵事項(xiàng)，幫助研究人員和實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員更好地使用這一工具。
一、操作步驟
1、準(zhǔn)備階段
1.1 試劑復(fù)溫：從冰箱取出試劑盒，室溫下復(fù)溫平衡約30分鐘，確保各組分達(dá)到適宜的檢測(cè)溫度。
1.2 洗滌液配制：用蒸餾水將試劑盒中提供的濃縮洗滌液稀釋至工作濃度。通常，按照1:20的比例進(jìn)行稀釋，即每份濃縮洗滌液加入19份純水。
2、樣品與標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)備
2.1 加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔。標(biāo)準(zhǔn)品孔中依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各50μl，待測(cè)樣本孔中先加入樣本稀釋液40μl，再加入待測(cè)樣本10μl(最終稀釋度為5倍)?？瞻讓?duì)照孔不加任何試劑。
2.2溫育：用封板膜封板后，置于37℃溫育30分鐘，使樣本中的IgE與包被在板上的抗體充分結(jié)合。
3、洗滌與加酶
3.1 洗滌：溫育結(jié)束后，小心揭掉封板膜，棄去孔內(nèi)液體，并在吸水紙上拍干。隨后，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌4次(或使用洗板機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化洗滌)，確保去除未結(jié)合的成分。
3.2 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl(空白對(duì)照孔除外)，再次封板后置于37℃溫育30分鐘，使酶標(biāo)抗體與已結(jié)合的IgE形成復(fù)合物。
4、顯色與終止
4.1 顯色：溫育結(jié)束后，每孔先加入顯色劑A液50μl，再加入顯色劑B液50μl，輕輕震蕩混勻，置于37℃避光顯色15分鐘。在此過程中，底物在辣根過氧化物酶(HRP)的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色產(chǎn)物，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。
4.2終止：每孔加入終止液50μl，終止顯色反應(yīng)(此時(shí)顏色由藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色)。
5、 結(jié)果測(cè)定
5.1 吸光度測(cè)定：在終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度(OD值)。以空白孔調(diào)零，記錄并保存數(shù)據(jù)。
5.2 濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及其對(duì)應(yīng)的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。根據(jù)待測(cè)樣本的OD值，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的IgE濃度。由于樣本進(jìn)行了5倍稀釋，因此最終濃度需乘以5。
二、注意事項(xiàng)
1. 樣本處理：樣本采集后應(yīng)盡早進(jìn)行提取，并按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行操作。避免使用含NaN3的樣本，因?yàn)镹aN3會(huì)抑制HRP的活性。
2. 操作規(guī)范：實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格遵守說明書操作，確保每一步驟的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對(duì)照都應(yīng)做雙份檢測(cè)，以減小實(shí)驗(yàn)誤差。
3. 交叉污染：為避免交叉污染，每加一個(gè)樣本或試劑就應(yīng)更換一次吸頭。酶標(biāo)工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分應(yīng)懸臂加樣，不得碰到微孔。
4. 試劑保存：試劑盒應(yīng)在2-8℃條件下避光保存，不同批號(hào)的試劑不得混用。未開封的酶標(biāo)包被板應(yīng)裝入密封袋中加干燥劑保存。
5. 結(jié)果解讀：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定應(yīng)以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，避免主觀判斷。若顯色過淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)底物溫育時(shí)間，但需注意控制時(shí)間以避免背景過高。
綜上所述，小鼠IgE試劑盒在操作過程中需細(xì)致入微，從試劑復(fù)溫、樣本處理到結(jié)果測(cè)定，每一步都需嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。只有這樣，才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為科學(xué)研究提供有力的數(shù)據(jù)支持。
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