探索寡核苷酸雜質分離｜Shim-pack Scepter Claris液相色譜柱

具有治療潛力的核酸和mRNA疫苗在制藥工業(yè)成為新的增長點。其中寡核苷酸發(fā)展迅猛，寡核苷酸是由20到60個堿基組成的單鏈或雙鏈核酸片段。包括反義寡核苷酸（ASOs）、小干擾RNA （siRNA）、microRNA以及適配體。在生物化學、分子生物學和遺傳學中有著廣泛的應用。

寡核苷酸由于細胞外穩(wěn)定性低，溶劑被核酸酶解，同時難以進入細胞等因素的影響發(fā)展緩慢，近些年，由于核酸修飾（磷酸骨架，堿基以及糖環(huán)的修飾）以及遞送介質（脂質體等）等相關技術的突破，使其成為繼小分子藥物、抗體蛋白質藥物之后，出現(xiàn)的一類新模式藥物，是近年藥物開發(fā)的熱點之一。

寡核苷酸的結構決定了它極性非常強，在常規(guī)的反相色譜柱上很難保留，可以使用HILIC模式、離子交換模式或者借助于離了對試劑在反相柱上實現(xiàn)保留，不同分離模式各自有自己的局限性。IP-RP作為其中常用的一種，應用范圍較廣，今天我們從方法開發(fā)的角度一探究竟。

Part 1 方法初篩

不同離子對試劑的選擇對于物質的保留差異較大。此次分析的樣品是20個堿基的寡核苷酸，優(yōu)先選擇TEA作為離子對試劑，后期因為涉及進質譜進行質量確認，所以加入了100mmol的HFIP增加靈敏度。采用不同比例的有機相、結合不同濃度的緩沖鹽濃度，優(yōu)化色譜方法，得到24張色譜圖，疊加如下文圖1所示。

系統(tǒng): Nexera XS inert

色譜柱: Shim-pack Scepter Claris C18(100 mm x2.1 mm l.D.,3 um,P/N:227-31210-05)

溫度: 60°C

進樣量:2 μL

流速: 0.4 mL/min

泵A

-Line A: 100 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液

- Line B:100 mmol/L HFIP水溶液

-Line C: 200 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液- Line D: 200 mmol/L HFIP水溶液

泵B

- Line A: 乙腈

- Line B: 甲醇

時間程序(%B):6%(0 min)>24 %(36 min)>50 %(36-37 min)>6%(37-46 min)

檢測器:260 nm(SPD-M40,UHPLC惰性流通池)

質譜系統(tǒng):LCMS-2050

離子源: ESI/APCI(DUISTM),負模式

掃描模式: SCAN(m/z 500-2000)

霧化器: 2.0 L/min(N2)

干燥氣: 5.0 L/min(N2)加熱氣:7.0 L/min(N2)

DL溫度:200°C

溫度: 450°C

電壓:-2.0 kV

整體色譜柱峰形優(yōu)異，惰性化柱管對于因柱管導致的峰形拖尾等問題，改善明顯。

從②⑤⑧可以看出，隨著離子對試劑濃度的增加，保留提升，分離得到進一步的改善。

HFIP濃度以及有機相的比例會影響基線，200mmol/L的HFIP中有100%純乙腈流動相會引起基線的抬升，比如?, ?, ?和?的實驗結果。對比結果⑧和結果?，可以看出HFIP的提升，對于分離展現(xiàn)出不同的效果。此外，在一些文章中也提到需要在流動相中加入一定比例的HFIP，這樣使得TEA的溶解度變小， 因而TEA更容易綁縛在固定相上形成更穩(wěn)定的離子對試劑層 。這促使離子相互作用的分離機制非常顯著，尤其針對于硫代寡核苷酸。

從②③的實驗結果可以看出，不同的有機試劑含量對于雜質分離展現(xiàn)不同的選擇性。不同流動相HFIP和TEA中的濃度、以及有機溶劑乙腈與甲醇的混合比例對FLP和FLP相關雜質分離影響較大。

最終，通過矩陣設計，考察分離效果，結果表明實驗條件⑤的分離效果佳，采用的流動相條件為:100mM HFIP 10mM TEA/ACN 50%_MeOH 50%。

Part 2 方法優(yōu)化

參考以上分離結果，進一步優(yōu)化有機相混合比例、柱溫以及梯度條件。

發(fā)現(xiàn)40%甲醇-60%乙腈混合比例對于寡核苷酸的分離效果更優(yōu)。

文獻中提到升高的柱溫通常減小峰寬，從而一定程度上改善了雜質分離，因此也是主要的一個影響因素。Scepter Claris C18色譜柱采用雜化硅膠，不僅具有雜化硅膠可以耐受高柱溫的特性，而且Scepter Claris色譜柱采用生物惰性涂層，相比于其他柱管的惰性化程度，惰性更優(yōu)，峰形改善更明顯。所以，進一步優(yōu)化如圖3所示，柱溫65℃的峰展寬更弱，峰形更窄。

最后考察了洗脫的梯度，優(yōu)化梯度條件，確定優(yōu)的梯度檢測條件。

最終確定了檢測條件如圖5所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)實現(xiàn)從不同角度優(yōu)化方法，實現(xiàn)了n-1、PO等雜質的良好分離。

同時，在寡核苷酸的分析檢測中，除了C18色譜柱應用較多，C4色譜柱由于區(qū)別于C18的選擇性，應用也非常多，常見于生物分析等。

采用島津Nexera XS inert 系統(tǒng)，配套島津全新惰性雜化硅膠色譜柱——Shim-pack Scepter Claris C18，從流動相比例、梯度、柱溫等方面優(yōu)化方法，避免了不銹鋼柱管吸附導致的峰形問題，有效實現(xiàn)寡核苷酸的分離分析。結合LabSolutions MD可實現(xiàn)整個工作流程優(yōu)化自動化，包括生成分析進度表、如自動峰值跟蹤具體的數(shù)據(jù)處理功能、色譜的評價值和設計空間等，有效提升方法開發(fā)的效率。