你知道如何去除重組蛋白的融合標(biāo)簽嗎？來(lái)看看吧！

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百歐博偉生物：由于基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們可以自由地將各種基因進(jìn)行隨意的進(jìn)行組合，表達(dá)出多種功能的蛋白質(zhì)。蛋白融合標(biāo)簽技術(shù)作為 DNA 重組技術(shù)的代表，通過(guò)在基因水平上改造目標(biāo)蛋白，產(chǎn)生含有融合標(biāo)簽的重組蛋白，兼具了原有蛋白質(zhì)的功能活性和融合標(biāo)簽所的生理生化特性。隨著蛋白藥物的飛速發(fā)展，融合標(biāo)簽技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于科研及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域，尤其在蛋白質(zhì)分離純化、膜蛋白結(jié)構(gòu)研究、蛋白質(zhì)生化功能研究等方面有著重要作用。

雖然融合標(biāo)簽具有十分多的優(yōu)點(diǎn)，可以使蛋白的純化更加的快捷方便、能夠促進(jìn)目的蛋白的正確折疊和可溶表達(dá)、利于蛋白質(zhì)的表達(dá)和定位等；但是有時(shí)對(duì)目標(biāo)蛋白也會(huì)造成不利影響。其主要表現(xiàn)在：①融合標(biāo)簽可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的構(gòu)象。例如蛋白連接GST標(biāo)簽后，雖然蛋白質(zhì)的可溶性增加了，但是蛋白質(zhì)構(gòu)象卻發(fā)生了很大的變化。因此，在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)，需要移除融合標(biāo)簽，排除融合標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響；②融合標(biāo)簽可能會(huì)抑制和影響目標(biāo)蛋白的活性。例如，對(duì)用于癌癥治療的單抗 CC49 單鏈 Fv 片段(scFv)的研究表明，當(dāng)多聚組氨酸標(biāo)簽與 scFv 的 C 端相連接時(shí)，會(huì)對(duì) scFv 部分抗原結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行覆蓋，從而降低 scFv 對(duì)抗原的結(jié)合能力。

在研究蛋白質(zhì)或酶的性質(zhì)或功能時(shí)，往往需要考慮融合標(biāo)簽的對(duì)其是否有影響。對(duì)于藥用蛋白質(zhì)，融合標(biāo)簽可能會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的藥效產(chǎn)生不利影響，此外還會(huì)對(duì)人體健康存在潛在影響，因而很有必要將融合標(biāo)簽進(jìn)行去除。

移除融合標(biāo)簽最長(zhǎng)常用的方法可分為：化學(xué)法、外切蛋白酶法、內(nèi)切蛋白酶法和基于內(nèi)含肽的自我剪切法。

一、化學(xué)法

化學(xué)方法移除多肽標(biāo)簽所采取的基本策略為：在目標(biāo)蛋白與融合標(biāo)簽之間插入一個(gè)甲硫氨酸殘基，蛋白被誘導(dǎo)表達(dá)和純化后，用溴化氰或羥胺處理該融合蛋白，使目標(biāo)蛋白與融合標(biāo)簽在插入的甲氨酸殘基處斷裂，從而使標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白分開(kāi)。

溴化氰(CNBr)解法是多種化學(xué)法中最重要的也是見(jiàn)的方法。由Gross和witkop于1962年建立的，后人進(jìn)行了系統(tǒng)研究，能專一裂解甲硫氨酸殘基的羧基端，產(chǎn)率達(dá)到85%。由于蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸含量一般都比較少，因此裂解后的肽段較少，新生成的肽段往往是大肽段。

化學(xué)法的優(yōu)點(diǎn)：化學(xué)法具有效率高、耗時(shí)短、成本低等。缺點(diǎn)：所需的反應(yīng)條件容易破壞目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，而且所使用的溴化氰等試劑具有毒性，此法不適合于藥用蛋白；如果目標(biāo)蛋白含有內(nèi)源甲氨酸殘基，會(huì)發(fā)生非特異性斷裂，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白被破壞；此外，化學(xué)法切割時(shí)容易產(chǎn)生副反應(yīng)，會(huì)對(duì)一些氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行修飾從而改變目標(biāo)蛋白本來(lái)的性質(zhì)。

二、外切蛋白酶法

外切蛋白酶能夠從蛋白質(zhì)的 N 端或 C 端開(kāi)始，依次切除一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，直到遇到某種特定的氨基酸殘基才會(huì)停止切割。外切蛋白酶的種類包括氨基肽酶和羧基肽酶，分別可以切除蛋白的 N 端和 C 端的融合標(biāo)簽，例如氨基肽酶M (APM)和羧肽酶 A和B(CPA和CPB)等。

對(duì)于外切蛋白酶法切除融合標(biāo)簽應(yīng)用中，代表性的是基于二肽氨基肽酶(DPPI，商品名為DAPase)的作用機(jī)理所提供的 TAGZyme 系統(tǒng)，用于去除 N 端的多聚組氨酸標(biāo)簽。DAPase 能夠從蛋白質(zhì) N 端依次切除二肽，當(dāng)?shù)鞍椎?N 端出現(xiàn) Lys、Arg、Gln 殘基，或者在 N 端第2個(gè)或第3個(gè)氨基酸殘基是Pro時(shí)，切除反應(yīng)終止，酶切完成。

外切蛋白酶的作用獨(dú)立于目標(biāo)蛋白內(nèi)部的序列，不會(huì)造成非特異性切割，幾乎可以適用于任何目標(biāo)蛋白。外切蛋白酶完成酶切的時(shí)間相對(duì)較短，也降低了造成目標(biāo)蛋白變性失活可能性。外切蛋白酶完成酶切所需酶量也少于內(nèi)切蛋白酶的用量，不但減少了非特異性切割的風(fēng)險(xiǎn)，還降低了后續(xù)去除該酶的難度。

三、內(nèi)切蛋白酶法

內(nèi)切蛋白酶能夠識(shí)別蛋白質(zhì)的特定氨基酸序列，并從該序列內(nèi)部或附近的特定氨基酸殘基處進(jìn)行切割。使用內(nèi)切蛋白酶時(shí)的一般策略：①選擇合適的內(nèi)切蛋白酶，注意目標(biāo)蛋白內(nèi)部有多余的酶切位點(diǎn)；②構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)，在融合標(biāo)簽與目的蛋白之間引入內(nèi)切蛋白酶識(shí)別序列；③構(gòu)建質(zhì)粒、導(dǎo)入宿主并誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化重組融合蛋白；④內(nèi)切蛋白酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切；⑤再次純化，去除內(nèi)切蛋白酶和融合標(biāo)簽。

在利用內(nèi)切蛋白酶去除融合標(biāo)簽時(shí)，內(nèi)切蛋白酶的特異性和酶切效率主要受 3 種因素影響：①內(nèi)切蛋白酶固有的非特異性酶切。如 Factor Xa 和凝血酶通常具有第二切割位點(diǎn)，并且第二位點(diǎn)的切割效率會(huì)隨著反應(yīng)條件的不同而變化。非特異性切割可以通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件減少，但不能消除 ，因此在優(yōu)化條件時(shí)，需要檢測(cè)切割后的產(chǎn)物，以確定目標(biāo)蛋白產(chǎn)物的均一性；②目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)。當(dāng)融合蛋白的酶切識(shí)別位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的內(nèi)部時(shí)，內(nèi)切蛋白酶活性中心難以識(shí)別到該位點(diǎn)，致使酶切效率變低。如在使用腸激酶對(duì)處于聚集狀態(tài)的目標(biāo)蛋白所含的多聚組氨酸標(biāo)簽的切除時(shí)，只有使目標(biāo)蛋白的腸激酶的切割識(shí)別位點(diǎn)暴露出來(lái)后，才能獲得較高的酶切效率。③溶液中化學(xué)成分對(duì)酶切活性會(huì)產(chǎn)生影響，如去垢劑。在純化跨膜蛋白時(shí)，通常需要加入去垢劑，可能會(huì)影響內(nèi)切蛋白酶的酶切效率。

在利用內(nèi)切蛋白酶切除融合標(biāo)簽之后，通常需要將內(nèi)切蛋白酶除去掉。因此在內(nèi)切蛋白酶時(shí)，盡量選取含有親和標(biāo)簽的內(nèi)切蛋白酶，在酶切完成后，通過(guò)二次過(guò)柱使帶親和標(biāo)簽的內(nèi)切蛋白酶吸附在柱上，而目標(biāo)蛋白則洗脫下來(lái)。

四、基于內(nèi)含肽的自我剪切法

內(nèi)含肽(intein)是前體蛋白中的一段插入序列，能夠自我催化蛋白質(zhì)的剪接(protein splicing)，使自身從前體蛋白中切除，并將兩側(cè)的外顯肽(extein)連接形成成熟的蛋白。

相比于化學(xué)法，自我剪切法條件溫和，不會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的變性。相對(duì)傳統(tǒng)的酶切法需要多次過(guò)柱純化（不僅需要分離融合蛋白還需除去蛋白酶及融合標(biāo)簽），自我剪切法簡(jiǎn)化了純化過(guò)程，節(jié)約了成本和時(shí)間。 此外，自我剪切法具有良好的特異性，一般只在剪接位點(diǎn)的氨基酸殘基上發(fā)生切割，避免了酶切法由于第二識(shí)別位點(diǎn)因素的存在發(fā)生的非特異性切割。但是自我剪切法在誘導(dǎo)剪切時(shí)需加巰基試劑，會(huì)影響目標(biāo)蛋白的二硫鍵。

以上4 種方法各有利弊，需要綜合考慮目標(biāo)蛋白的特性，以及標(biāo)簽移除方法和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇合適的方法。

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