NanoDrop微量分光光度計的應(yīng)用

NanoDrop微量分光光度計的應(yīng)用

快速評估您的樣品中所含的核酸、蛋白質(zhì)和污染物

當(dāng)您知道樣品的含量和純度時，您便可以做出是否在下游實驗中使用這些樣品的明智決策。Thermo Scientific NanoDrop 分光光度計系列可以幫助您快速評估樣品中是否含有適量您所需的物質(zhì)。根據(jù)您選擇的儀器，軟件還可以在存在污染物時提醒您并鑒別污染物是什么。

NanoDrop 分光光度計的核心功能是核酸和蛋白質(zhì)定量分析與純度評估，這是許多下游應(yīng)用（特別是 RT-qPCR 和質(zhì)量控制）中的步驟。另外，該儀器還支持細(xì)菌培養(yǎng)生長、動力學(xué)等應(yīng)用以及液體聚合物 QC 等化學(xué)計量應(yīng)用

核酸定量

傳統(tǒng)上，通過測定以下三個分析波長處的紫外吸光度來定量核酸：230 nm、260 nm 和 280 nm。這些吸光度測量允許科學(xué)家測定核酸濃度并指示樣品純度。260 nm 處的最大吸光度峰的強度與核酸濃度成正比。

該核酸定量方法的優(yōu)勢在于操作簡單、直接，僅消耗少量樣品。然而，該方法存在的一個問題是它缺乏特異性，因為在這些波長處存在吸收的任何污染物都會導(dǎo)致獲得的核酸濃度不準(zhǔn)確。

隨著紫外-可見光軟件的發(fā)展，研究人員現(xiàn)在可以在存在化學(xué)和核酸污染物的情況下選擇性地定量核酸吸光度。Thermo Scientific Acclaro 智能技術(shù)軟件（賽默飛NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計中的標(biāo)準(zhǔn)軟件）使用全光譜數(shù)據(jù)和高級的算法來鑒別常見的核酸污染物并提供經(jīng)過校正的核酸濃度。Acclaro 算法可以檢測 RNA 中的 dsDNA 污染以及 dsDNA 中的 RNA 污染。您還可以輸入自定義寡核苷酸序列，軟件將自動計算應(yīng)用于核酸定量的因子。

NanoDrop One/One? 分光光度計上的預(yù)編程核酸應(yīng)用

點擊以從核酸主屏幕中選擇您需要的應(yīng)用。

標(biāo)記核酸的定量

熒光標(biāo)記的核酸可通過微陣列預(yù)配置軟件方法進(jìn)行定量，該方法可提供核酸濃度及標(biāo)記濃度（支持兩種染料）。該方法作為 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 儀器上的預(yù)配置應(yīng)用提供。

污染物鑒別

Acclaro 樣品智能技術(shù)使得 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 微量分光光度計能夠鑒別常見污染物并提供真實的樣品濃度，從而提供有關(guān)樣品質(zhì)量的更多信息。Acclaro 軟件納入了依賴于光譜參考庫的算法。該軟件將這些算法應(yīng)用于樣品光譜，并使用化學(xué)計量數(shù)學(xué)原理對樣品污染物進(jìn)行預(yù)測。

Acclaro 污染物鑒別

Acclaro 軟件已標(biāo)記該 dsDNA 樣品（黃色圖標(biāo)），因為它被苯酚污染。從原始結(jié)果（總 A260，藍(lán)色）中減去苯酚的吸光度貢獻(xiàn)（橙色），得到了樣品中經(jīng)過校正的真實 dsDNA 濃度（綠色）。

Acclaro 參考庫目前支持檢測 dsDNA 樣品中的蛋白質(zhì)、苯酚、鹽酸胍和 RNA。另外還支持檢測 RNA 樣本中的蛋白質(zhì)、苯酚、硫氰酸胍和 dsDNA。最后，它們允許檢測蛋白質(zhì)樣品中的 DNA。未來將在參考庫中增加其他污染物。

污染物鑒別為研究人員提供了兩個方面的重要信息。首先，它可以鑒別可能存在于樣品中的特定污染物。此信息可能有助于科學(xué)家解決較難的提取或純化問題，并做出關(guān)于是否在下游實驗中使用樣品的決策。其次，它提供了經(jīng)過校正的分析物濃度。當(dāng)建立下游反應(yīng)（例如 PCR）時，DNA 濃度是一個關(guān)鍵參數(shù)，經(jīng)過校正的濃度將有助于科學(xué)家確保下游實驗的成功。

例如，基因組 DNA 制備中出現(xiàn) RNA 污染是分子生物學(xué)工作流程中的一個常見問題。使用傳統(tǒng)的分光光度法時，存在共純化的 RNA 會人為升高 DNA 濃度。通過使用全光譜數(shù)據(jù)和 Acclaro 軟件中提供的數(shù)學(xué)算法，研究人員可以鑒別 DNA 樣品中的 RNA 污染，并查看經(jīng)過校正的 DNA 濃度結(jié)果。

RT-qPCR 工作流程中的核酸定量

可靠的 RT-qPCR（定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR）檢測需要仔細(xì)的實驗設(shè)計、全面的質(zhì)量控制 (QC) 以及透明的數(shù)據(jù)分析。

RT-qPCR QC 中核酸定量的重要性

核酸定量在 RT-qPCR 過程的兩個酶法步驟中都至關(guān)重要。在逆轉(zhuǎn)錄步驟中，了解（和歸一化）進(jìn)入反應(yīng)的 RNA 量將有助于大大減少 cDNA 生產(chǎn)的變異性。在 PCR 步驟中，您必須確保有足夠的 cDNA 模板來確定樣品的基因型。

將 NanoDrop 分光光度計用于 qPCR 工作流程

NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 分光光度計非常適合定量和定性分析核酸樣品，作為下游 RT-qPCR 檢測的質(zhì)量控制步驟。這些儀器可提供準(zhǔn)確的核酸濃度并鑒別可能改變實驗結(jié)果的污染物，有助于防止實驗失敗或不能發(fā)表結(jié)果。

NanoDrop One 和 Eight 儀器內(nèi)置的 Acclaro 樣品智能技術(shù)可鑒別樣品中是否存在常見污染物并計算出污染物的近似濃度。核酸提取試劑盒中的常見分子可能會導(dǎo)致分析物濃度值被高估或使 qPCR 聚合酶變性。無論發(fā)生哪種情況，qPCR 實驗都可能失敗。Acclaro 軟件可以提供經(jīng)過校正的核酸濃度且可鑒定污染物，從而較大限度地減少對失敗實驗進(jìn)行故障排除和管理所花費的時間。

蛋白質(zhì)定量分析

科學(xué)家可以使用 NanoDrop 儀器，通過直接或間接測量法定量分析樣品中的蛋白質(zhì)含量。NanoDrop 紫外-可見光分光光度計支持在光譜的紫外波長范圍內(nèi)使用直接 A280 和 A205 測量應(yīng)用以及在可見光譜范圍內(nèi)使用比色檢測對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量分析。

NanoDrop One/One? 分光光度計上的預(yù)編程蛋白質(zhì)應(yīng)用

點擊以從蛋白質(zhì)主屏幕中選擇您需要的應(yīng)用。

蛋白質(zhì) A280 是一個直接測量應(yīng)用程序，可直接根據(jù)樣品在280或205 nm 處的吸光度以及蛋白質(zhì)特定消光系數(shù)來計算蛋白質(zhì)濃度。直接測量是一種受研究人員歡迎的選擇，因為其操作簡單，不需要試劑或標(biāo)準(zhǔn)品，并且只消耗極少量樣品。與核酸不同，蛋白質(zhì)顯示出相當(dāng)大的差異。蛋白質(zhì) A280 應(yīng)用適用于含有色氨酸 (Trp) 或酪氨酸 (Tyr) 殘基、半胱氨酸二硫鍵 (Cys-Cys) 并在280 nm 處顯示吸光度的純化蛋白質(zhì)。

比色檢測（如 BCA、Bradford、Lowry 和 Pierce 660 nm ）是 間接測量應(yīng)用，它們依賴生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和產(chǎn)生可顯示與樣品中的蛋白質(zhì)量成比例的顏色變化的反應(yīng)。細(xì)胞提取物或裂解物等復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)建議使用蛋白質(zhì)比色檢測進(jìn)行測量。

蛋白質(zhì)樣品評估是許多蛋白質(zhì)工作流程中的一個重要步驟。

為蛋白質(zhì)或肽樣品選擇適合的定量檢測

下列表格顯示了 NanoDrop 紫外-可見分光光度計上可用的蛋白質(zhì)定量方法的濃度范圍、描述和注意事項以及不同儀器上提供的各種方法。有關(guān)這些檢測的更多信息，請參閱我們的蛋白檢測選擇指南

NanoDrop 分光光度計支持的蛋白質(zhì)檢測方法

A280 可實現(xiàn)對大多數(shù)蛋白質(zhì)和肽的快速簡單定量分析

純化蛋白質(zhì)樣品可以使用 280 nm 處的直接吸光度進(jìn)行準(zhǔn)確測量，此處的吸光度主要歸因于 Trp 和 Tyr 氨基酸上的芳香鏈。蛋白質(zhì) A280（我們軟件中的一種預(yù)配置應(yīng)用）是較常用的定量方法，因為它快速簡單、不需要試劑或標(biāo)準(zhǔn)曲線，且樣品消耗量極少。

與核酸不同，每種純蛋白質(zhì)都具有基于氨基酸序列的比爾-朗伯消光系數(shù)。為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，請從菜單中選擇正確的樣品類型，或手動輸入其蛋白質(zhì)消光系數(shù)。NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 蛋白質(zhì)編輯器功能使您能夠保存特定蛋白質(zhì)的消光系數(shù)，以便您能夠自定義您的樣品類型選項。

除測量濃度外，NanoDrop 分光光度計還可提供樣品中污染物的相關(guān)信息。Acclaro 樣品智能技術(shù)（包含在 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 儀器上）使用數(shù)學(xué)算法來檢測蛋白質(zhì)樣品中的核酸，并根據(jù)需要校正濃度結(jié)果。也可以通過測量 A260/A280 比值來評估樣品純度；比值 >1 可能表明蛋白質(zhì)樣品中存在核酸污染。

A205 是一種直接測量選擇方法，甚至適用于不含酪氨酸和色氨酸的生物分子

如果蛋白質(zhì)或肽不含 Trp 和 Tyr 殘基因此不能使用 A280 應(yīng)用進(jìn)行測量該怎么辦？由于蛋白質(zhì)的肽骨架在 190-220 nm 處吸收光，因此不含 Tyr 或 Trp 殘基的肽可以通過測量 205 nm 處的吸光度來進(jìn)行定量分析。蛋白質(zhì) A205 是 NanoDrop 軟件中的一個預(yù)配置應(yīng)用。

也可以通過選擇 Scopes 法選項，使用 A205 應(yīng)用對含有大量 Trp 和 Tyr 的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。事實上，A205 方法相比 A280 蛋白質(zhì)方法具有一些優(yōu)勢，比如蛋白質(zhì)間變異性較低（因為 A205 消光系數(shù)并不基于氨基酸組成）和靈敏度更高（因為蛋白質(zhì)在 205 nm 處具有較高的摩爾吸光系數(shù)）。盡管技術(shù)上的限制使得這些測量在過去很難進(jìn)行，但 Nanodrop 儀器的樣品保留技術(shù)和低雜散光性能簡化了通過 A205 方法定量少量蛋白質(zhì)的流程。

A205 方法存在的一個局限性是許多常用的蛋白質(zhì)緩沖液在 205 nm 處有吸光度。在使用這一技術(shù)之前，建議檢查蛋白質(zhì)緩沖液在 205 nm 處的吸光度貢獻(xiàn)。

細(xì)胞提取物或裂解物中蛋白質(zhì)的比色檢測

細(xì)胞提取物或裂解物等復(fù)雜混合物中的蛋白質(zhì)建議使用蛋白質(zhì)比色檢測進(jìn)行測量，如 Bradford、BCA、Lowry 或 Pierce 660nm 檢測。這些檢測可提供蛋白質(zhì)特異性濃度，避免了在紫外范圍內(nèi)吸光并會使 A280 增大的細(xì)胞組分的吸光度。這些應(yīng)用和其他應(yīng)用已預(yù)配置在選定的 NanoDrop 儀器上。

使用 NanoDrop One/One? 分光光度計進(jìn)行 BCA 蛋白質(zhì)檢測

BCA 檢測結(jié)果顯示總蛋白濃度（3 個紅色菱形）和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)記蛋白質(zhì)的定量

標(biāo)記的抗體或其他熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)和金屬蛋白可以使用提供蛋白質(zhì)以及標(biāo)記濃度（支持 2 種染料）的蛋白質(zhì)和標(biāo)記預(yù)配置軟件應(yīng)用進(jìn)行定量。該應(yīng)用作為 NanoDrop One/OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計上的預(yù)配置應(yīng)用提供。

質(zhì)量控制實驗室

現(xiàn)在，質(zhì)量保證和質(zhì)量控制比以往任何時候都更加重要。在繁忙的 QC 實驗室中，NanoDrop 分光光度計可使樣品濃度和純度分析變得可重現(xiàn)、常規(guī)和可靠。將下一代樣品質(zhì)量評估集成到您的工作流程中產(chǎn)生了很大影響，因為時間非常寶貴，所有樣品的質(zhì)量都至關(guān)重要。

mRNA 疫苗質(zhì)量控制

例如，在 mRNA 疫苗（在對抗 SARS-CoV-2 中至關(guān)重要并且越來越多地用于對抗其他病毒）的生產(chǎn)過程中，樣品濃度和純度檢查在多個步驟中都非常有用。

在測序階段，起始材料的質(zhì)量和數(shù)量都是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的關(guān)鍵。

在質(zhì)粒生產(chǎn)中，必須檢查純化血漿是否存在基因組 DNA 和其他污染物。

在體外轉(zhuǎn)錄中，必須先檢查純化 mRNA 的純度，然后再將 mRNA 溶液灌裝到疫苗小瓶中。

細(xì)菌培養(yǎng)生長 (OD600)

可通過測量細(xì)菌培養(yǎng)物在 600 nm 處的光密度 (OD600) 來監(jiān)測細(xì)菌培養(yǎng)物的生長。盡管這是微生物學(xué)中的核心技術(shù)，但這些光學(xué)密度測量通常只能提供非常少的真實化學(xué)吸光度。相反，它們代表了由于細(xì)菌懸液散射而未進(jìn)入儀器的檢測器的光量。

您可以使用 OD600 預(yù)編程應(yīng)用在 NanoDrop OneC 和 NanoDrop Eight 分光光度計上測定 OD600。該軟件使用比爾-朗伯方程和用戶輸入的細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)換系數(shù)自動將 OD600 值轉(zhuǎn)換為每毫升細(xì)胞數(shù)。

請注意，在 NanoDrop OneC 儀器上，使用底座和比色皿選件將提供不同的 OD600 值。您可以使用轉(zhuǎn)換系數(shù)來比較基座和比色皿測量值。

基于時間的動力學(xué)測量

在 NanoDrop OneC 儀器上，您可以對比色皿中的樣品進(jìn)行基于時間的動力學(xué)測量。您可以190-850 nm 范圍內(nèi)的三個波長，按照用戶自定義的時間間隔（最多 5 個階段）進(jìn)行連續(xù)的吸光度監(jiān)測。比色皿測量提供擴大的檢測下限、可選的37°C加熱器和微型攪拌器。

您可以創(chuàng)建、編輯和保存動力學(xué)實驗作為自定義方法。

樣品動力學(xué)結(jié)果

使用 NanoDrop OneC，按照用戶定義的時間間隔在 10 分鐘內(nèi)檢測了該比色皿樣品在 260、340 和 660 nm 處的吸光度。

NanoDrop 分光光度計的自定義方法

如上文所述，NanoDrop 分光光度計預(yù)加載了核酸定量（如 dsDNA、ssDNA 和 RNA）和蛋白質(zhì)定量（如 A280、BCA 和 Bradford）方法。您還可以在 NanoDrop One/OneC 或 NanoDrop Eight 分光光度計上創(chuàng)建自定義方法來進(jìn)行紫外-可見光測量或其他用戶定義的測量以滿足您的需求，使儀器能夠像傳統(tǒng)分光光度計一樣發(fā)揮作用。自定義方法可以監(jiān)測和報告 190-850 nm 范圍內(nèi)的多達(dá) 40 個波長，并可以直接從觸摸屏或 PC 控制軟件進(jìn)行設(shè)置。自定義方法支持將您的儀器靈活用于其他應(yīng)用。

使用預(yù)先定義的自定義方法 來分析樣品，如通過 BCA 檢測分析納米顆粒、葉綠素、血紅蛋白、葡萄糖和蛋白質(zhì)。

創(chuàng)建新的自定義方法來分析您的特殊樣品，并保存方法供日后使用。

使用自定義方法測量各種形式的血紅蛋白

例如，利用合適的消光系數(shù)和吸光度峰值，分光光度計可用來定量各種形式的血紅蛋白。

氧合血紅蛋白含有結(jié)合氧，在 414 nm、541 nm 和 576 nm 處顯示吸光度峰。

脫氧血紅蛋白不含結(jié)合氧，在 431 nm 處顯示吸光度峰。

高鐵血紅蛋白由于含有高鐵離子而不能結(jié)合氧，在 406 nm 處顯示吸光度峰。

我們?yōu)?NanoDrop One/OneC 儀器創(chuàng)建了一種自定義方法，用于測量血紅蛋白在 406、414、431、541 和 576 nm（區(qū)分氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白和高鐵血紅蛋白所需的五個波長）處的吸光度。該結(jié)果圖顯示了高鐵血紅蛋白的典型吸收光譜。

高鐵血紅蛋白的典型吸收光譜

在 NanoDrop One 分光光度計上運行血紅蛋白自定義測量方法，結(jié)果顯示在 406 nm 處有吸收峰，這是高鐵血紅蛋白的典型峰。另外，光譜未顯示氧合血紅蛋白中存在的 541 和 576 處的吸收峰。

化學(xué)計量方法

化學(xué)計量學(xué)是使用多變量數(shù)學(xué)模型和統(tǒng)計方法來同時確定很多組分的定量濃度信息。當(dāng)用于分析復(fù)雜化學(xué)樣品（混合物）的紫外-可見光數(shù)據(jù)時，化學(xué)計量學(xué)可以提供一種有效的方法來測定具有重疊光譜的化學(xué)物質(zhì)的濃度。 過去，多變量校準(zhǔn)模型的復(fù)雜性限制了其只能由擁有相關(guān)領(lǐng)域豐富知識的人使用，因此大多數(shù)數(shù)據(jù)必須傳輸給經(jīng)驗豐富的化學(xué)計量學(xué)專家進(jìn)行收集后分析。

NanoDrop QC 軟件納入了化學(xué)計量學(xué)

Thermo Scientific NanoDrop QC 軟件為 NanoDrop OneC 微量測量平臺帶來了強大的化學(xué)計量分析功能。這種組合方式提供了一種具有吸引力的解決方案，適用于各種應(yīng)用，包括石化分析、藥物純度、聚合物制造、食品染料應(yīng)用以及需要化學(xué)計量分析的其他應(yīng)用。

NanoDrop QC 軟件簡化了化學(xué)計量方法的開發(fā)和部署。開發(fā)方法的科學(xué)家可以收集所選化合物的光譜并將其導(dǎo)入 Thermo Scientific TQ Analyst 軟件，用于構(gòu)建方法。然后，可以將方法直接部署到的NanoDrop OneC 紫外-可見分光光度計上，使 QC 技術(shù)人員能夠在工作場地獲得合格/不合格和其他定量結(jié)果。

使用化學(xué)計量學(xué)方法對液體聚合物進(jìn)行 QC

基于比色皿的紫外-可見光技術(shù)和基于 PC 的化學(xué)計量軟件是對染料、潤滑劑和粘合劑等液體進(jìn)行質(zhì)量分析的主要工具。這些溶液的樣品制備和分析可能包括多個影響高價值產(chǎn)品放行的耗時步驟。我們的創(chuàng)新型自動調(diào)節(jié)基座紫外-可見分光光度計省去了稀釋高濃度樣品等耗時的步驟，并簡化了化學(xué)計量方法開發(fā)數(shù)據(jù)分析。

定量分析復(fù)雜混合物，即使其光譜重疊

在我們的化學(xué)計量學(xué)應(yīng)用資料中，我們演示了逐步創(chuàng)建并驗證用于確定復(fù)雜混合物中單種偶氮染料的濃度的化學(xué)計量學(xué)方法。我們展示了如何使用 NanoDrop QC 軟件來獲取包含多種具有高度重疊紫外-可見光光譜的組分的樣品的定量信息。

純檸檬黃和日落黃的全紫外-可見光譜 (200-700 nm)

使用 NanoDrop QC 軟件的紫外-可見光模塊采集光譜，并在 800 nm 處進(jìn)行基線校正。制備每種染料的 10 mg/mL 和 2 µL 等分溶液，并在儀器上測量。