堵和漏——液相色譜的兩大“病癥”，咋解決？

液相色譜儀是屬于易學(xué)難用的儀器，特別講究“正確使用”和經(jīng)驗(yàn)。液相工作者接觸多的是流動相，流動相也是造成液相色譜各種問題的主要源頭。液相色最常見的故障一是堵，二是漏。下面就這兩分別展開討論（流動相以甲醇為例，色譜柱以C18為例） 。

一·為何會堵

“堵”的表現(xiàn)現(xiàn)象就是柱壓異常升高，直接原因就是流路不暢。堵塞的主要位置就是在色譜柱的前端，主要原因就是流動相里有雜質(zhì)，雜質(zhì)的主要來源就是細(xì)菌。
   首先我們要認(rèn)識到，一般的國產(chǎn)甲醇其實(shí)不需要額外過濾處理，直接使用沒有問題。即使是有些固態(tài)微粒雜質(zhì)，也能在液相流路系統(tǒng)前端的過濾頭上排除，真正容易引起問題的，是水中的細(xì)菌。新制備的純水在室內(nèi)放置幾天就會長菌，而這些細(xì)菌雖然肉眼不可見，卻足以堵塞柱填料顆粒的空隙，造成柱子很快報(bào)廢。這就是在配制流動相時(shí)造成的細(xì)菌污染的原因，解決它的方法很簡單，就是確保水的可靠性。

有兩種方式推薦：

（1）理想的方式當(dāng)然是購買實(shí)驗(yàn)室專用純水機(jī)，既方便又可靠，質(zhì)量也放心。缺點(diǎn)就是價(jià)格不菲。

（2）成箱購買市售品牌純凈水，如500ml一支的怡寶或娃哈哈，這些水的質(zhì)量足以應(yīng)付液相色譜的要求。先隨機(jī)抽取一支做一下細(xì)菌平板實(shí)驗(yàn)，待菌落數(shù)合格方可使用。這樣每次只要單獨(dú)開一支即可，也很方便。每次成本2元左右。這里特別指出一個細(xì)節(jié)：在絕大多數(shù)書本上，凡談到配制流動相都會談到后一個過濾的步驟。但是從我們長期使用的實(shí)際效果來說，只要能保證水的質(zhì)量，這一步可以也應(yīng)當(dāng)去除。

水有保證 可以不過濾？

原因有以下兩點(diǎn)：

（1）流動相過濾在理論上有好處，但是實(shí)際操作時(shí)由于不可能做到專瓶專用，反而容易造成的交叉污染，對于配比復(fù)雜的流動相影響更大。

（2）流動相過濾在經(jīng)濟(jì)成本上不劃算。買一套過濾裝置要6000多元，且過濾器是比較容易損壞的設(shè)備。主要是過濾片的成本太高，一片就要幾十元。按一般液相柱的正常使用壽命計(jì)算，過濾片的成本會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于色譜柱的成本上升。

“堵”的原因之一：純水中的細(xì)菌污染

指的是：流動相剛開始不長菌，在使用時(shí)卻產(chǎn)生了細(xì)菌污染。這主要是在使用多元液相色譜儀時(shí)的一種不良使用習(xí)慣造成的。舉簡單的例子：50%的甲醇水流動相，有兩種使用方式。一種方式是在上機(jī)前就配好混合在一起，另一種方式是在流路A放純甲醇，流路B放純水。從單純實(shí)驗(yàn)效果來說，后一種有明顯的優(yōu)點(diǎn)：首先是簡單，不需要實(shí)驗(yàn)者另個計(jì)算配比混合，其次就是比例準(zhǔn)確，能得到保留時(shí)間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)效果。

但是，它有一個致命的缺陷，就是純水在流動相瓶中幾天時(shí)間就會長細(xì)菌（很多情況下不僅僅用純水作流動相，而是用緩沖鹽溶液，本身就是優(yōu)質(zhì)肥料，細(xì)菌長得更迅速），一旦有細(xì)菌柱子就壞得很快。所以這種方式要求操作人員每次實(shí)驗(yàn)都要用新制備的純水，更要求在每次實(shí)驗(yàn)后把水相換掉，換成甲醇沖洗干凈，這一點(diǎn)在實(shí)際工作中很多人意識不強(qiáng)，就是意識到了但多次使用中總有一兩次會遺漏，但是往往這一兩次就足以產(chǎn)生致命的影響。因?yàn)橐合嗌V柱的堵塞是不可逆的。

所以，寧可犧牲小小的保留時(shí)間的重復(fù)性，也不要用純水溶液作為流動相的一組。從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果來說，我建議用10%的甲醇水代替水溶液（以前我做過不同比例甲醇水的細(xì)菌總數(shù)實(shí)驗(yàn)，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以殺菌了），這樣可以有效排除長細(xì)菌的隱患，既可作流動相，也可沖柱。就算是在配制流動相時(shí)會計(jì)算得麻煩一些，但是一次麻煩，終身受益。

“堵”的原因之二：使用流動相時(shí)的細(xì)菌污染

作

常見問題有以下幾種：

（1）在更換零件時(shí)選擇的型號有誤，接口不是很匹配，在擰緊的時(shí)候產(chǎn)生變形而使得管路堵塞。

（2）樣品處理液凈化得不干凈，長期會在六通閥和柱之間形阻塞不暢。

（3）在使用用手動六通閥時(shí)，有些人可能由于手勁小的原因，轉(zhuǎn)動的不到位，于是造成流路形成死堵，壓力快速升高超過警戒值。

（4）在使用金屬管路作出廢液管時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意好廢液瓶中先放一些水，并把廢液管的出口端結(jié)晶成塊并造成堵塞。這種情況不常見，但卻的確發(fā)生過。

查堵的方法

在發(fā)生“堵”的現(xiàn)象后，就需要找出原因，主要是什么位置發(fā)生了“堵”。

注意，絕大多數(shù)情況下，整個系統(tǒng)只會有一個地方發(fā)生堵塞。查堵的方法是從尾向前逆向分段拆開，仔細(xì)觀察壓力數(shù)值，如果某一個部件（柱子除外）裝上和拆下時(shí)的壓力差別很大，可發(fā)展變化判斷。至于柱的堵塞，可以通過換同樣規(guī)格的柱的壓力是否一致來判斷。

溶劑入口過濾頭

未經(jīng)過濾的溶劑或溶劑瓶中生長的微生物都會降低溶劑入口過濾頭的壽命,并影響泵性能.一般3個月清洗或更換。將溶劑入口管從過濾頭和瓶蓋組件處撥下,如果管線中充滿溶劑,當(dāng)過濾頭性能良好時(shí),溶劑會自由地從管中滴出．如果堵塞，就沒有溶劑或只有很少量的溶劑從管中滴出。不要使用超聲清洗溶劑入口過濾頭，否則玻璃顆粒可能是破碎造成堵塞。

二·為何會泄露

過濾膜的類型

聚四氟乙烯膜（一般用于有機(jī)相）幾乎可以和所有的溶劑、酸和堿相容。

尼龍66膜（一般用于有機(jī)相）可以和大多數(shù)溶劑、有機(jī)物和水相容，建議不要用于強(qiáng)酸、二氯甲烷和DMF。

纖維素硝酸酯(一般用于水相)主要用于過濾器,可以和多數(shù)水性和非水性溶劑相溶,但不是所有的水性和非水性溶劑。

再生纖維素膜一般用于HPLC生物樣品和有機(jī)溶劑的制備和過濾,是通用型HPLC過濾器,具有廣泛的溶劑相溶性,與蛋白質(zhì)鍵合作用低,非常低的可萃取性.在樣品溶液中有顆粒存在會造成故障時(shí)要用膜進(jìn)行過濾。

“漏” 分兩種：漏液和漏氣

漏液：液相色譜儀從流動相瓶到廢液瓶之間的流路是一個全封閉體系，內(nèi)部壓力很高，但外部卻能保證一滴不漏。如果某個部件發(fā)生漏液，那就是故障所在。

漏液的原因分兩種：

接觸硬件不當(dāng)：在更換零件如流路管或換柱時(shí)，換的接頭接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接頭很多是不同的，甚至同一家公司在不同時(shí)期生產(chǎn)的液相柱接頭也有很大區(qū)別。當(dāng)然選項(xiàng)用PEEK接頭是一較好是一個較好的解決方法，不僅通用性好，而且靠手?jǐn)Q就能保證不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不當(dāng)也會漏液，一種不當(dāng)就是力度把握不好，擰得太緊或太松；另一種不當(dāng)就是致命的錯誤：滑絲，這往往是動手能力不太強(qiáng)，螺絲釘很少擰的工作者犯的錯誤，滑絲的后果不僅是漏液那么簡單，常造成重要部件的報(bào)廢。解決這個問題只能靠惡補(bǔ)基本功來實(shí)驗(yàn)，那就是擰螺絲。

使用儀器不當(dāng)：只要互相有10%比例就不會出現(xiàn)這個問題。另一原因是在用緩沖液鹽溶液（不論甲醇含量有多少）作流動相時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沒有換甲醇水沖洗，使得微滲的流動相干燥形成晶體造成。不過，輸送泵漏液并不是非得馬上修不可，沖洗干凈并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。檢測器漏液是個很麻煩的事，一般都是吸收池的問題，更換的費(fèi)用相當(dāng)高。但是并不是說一定要馬上更換，還可以從實(shí)際實(shí)驗(yàn)效果看能否湊合使用。

漏氣：漏液是從內(nèi)部向外漏，而漏氣則是外部了的氣體進(jìn)入液相色譜儀的流路內(nèi)部形成氣泡。下面按流路的方向逐個部件分析產(chǎn)生氣泡的原因和相應(yīng)解決方法。

2.1過濾頭：油液時(shí)，在流路管中有不規(guī)則但持續(xù)的小氣泡產(chǎn)生，這時(shí)考慮的是流動相有沒有脫氣（需要特別提醒即使是有了真空脫氣機(jī)也是要先超聲脫氣的，起碼可以減少脫氣機(jī)的工作壓力并提高工作效率），如果已經(jīng)脫砂壓力了氣，則要注意過濾頭的污染也會造成這種現(xiàn)象。處理方法比較簡單，擰下過濾頭在稀硝酸中浸泡，超聲半小時(shí)，洗凈后裝回去即可。

2.2透明流路管：指的是在過濾頭和輸送泵之間的那一段管路。這一個部分往往不是有點(diǎn)氣泡，而經(jīng)常是整個管中全是空氣而操作人員卻渾然不知，以致輸送泵工作了半天才發(fā)現(xiàn)流動相瓶里的液體一點(diǎn)也沒少。這也是我們常說的液相色譜儀至少一周要開機(jī)一次的原因（我們做液相一定要有“微滲”的概論）。如果長時(shí)間不用，這一段管路的液體會徹干掉，而充滿空氣的管路和充滿液體的管路不仔細(xì)看是分辨不出來的。這種情況對于輸送泵很危險(xiǎn)，因?yàn)楸脧脑O(shè)計(jì)來說是輸送液體而不是輸送氣體，內(nèi)部的液體對于活塞來說起到了機(jī)油的作用，如果活塞桿還殘存了一些緩沖鹽，則極易拉傷，造成不可逆轉(zhuǎn)的影響。對于這種情況，要突出“預(yù)防為主”如：液相色譜使用人員要相對固定和穩(wěn)定，工作中合理搭配資源，每臺機(jī)一周至少一次實(shí)驗(yàn)，如長期不用起碼每周要沖流動相2小時(shí)。養(yǎng)成良好的工作習(xí)慣很重要。

如果流路管中真漏氣了怎么辦？

建議是用外力使管路中充滿液體。具體如下：

1、找到流路管進(jìn)入輸送泵的接頭。

2、擰下來。

3、用一干凈洗耳球?qū)?zhǔn)管路的平整切口。

4、吸液體，看液面從流動相瓶里上升，至離洗耳球5cm左右時(shí)停止該動作。

5、快速把接頭擰回輸送泵上（這個過程可能會有少許流動相外泄，這是正?，F(xiàn)象）。

6、開機(jī)，打開排液閥門，啟動輸送泵。

7、等排液管中流出的溶液沒有氣泡時(shí)，再關(guān)閉排液閥，儀器正常工作。

2.3輸送泵和柱子：這些部分進(jìn)了氣泡一般不怕，沖掉就行。

2.4檢測器：應(yīng)該說，整個流路中只要有一個氣泡都會在檢測器上得到強(qiáng)烈的信號反映，檢測器內(nèi)部的氣泡一般都能被沖走，但也有很難沖掉的殘留氣泡的情況。如果檢測器內(nèi)有殘留氣泡，會有特別明顯的表現(xiàn)形式，就是在走基線時(shí)會時(shí)不時(shí)間隔出現(xiàn)直上直下信號很大的信號峰。這時(shí)先看普通流量能否沖走，如果沖不走，辦法就是拆柱，把檢測器直接連接到輸送泵的出口，加大幾部流量沖洗，則肯定能沖走氣泡。