實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實驗步驟

       實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學(xué)技術(shù)。該方法利用熒光染料或探針，當(dāng)與擴增的 DNA 或 RNA 分子結(jié)合時會發(fā)出信號，從而可以對目標(biāo)序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應(yīng)用。

RT-qPCR原理的三個主要步驟：

1 反轉(zhuǎn)錄：

使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴增的DNA形式。

反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。

2 PCR擴增：

使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。

PCR是一個循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴增DNA模板的數(shù)量。

PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號。

3 熒光實時檢測：

使用實時PCR儀器實時監(jiān)測熒光信號。

熒光的數(shù)量與每個PCR循環(huán)中擴增的DNA數(shù)量成比例。

使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。

實驗步驟：

1、RNA提?。篟NA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。

A、離心機4℃預(yù)冷，準(zhǔn)備試劑：氯仿、異內(nèi)醇、75%乙醇（用DEPC水配制）、無RNase的水或DEPC水、無酶吸頭及試管，戴口罩、帽子、無粉乳膠手套；

B、取出轉(zhuǎn)染建模成功24h后的細胞，吸棄培養(yǎng)液，用1×PBS清洗1次；

C、每10cm2生長的細胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細胞使其全脫落；

D、用移液槍反復(fù)吹吸裂解液直至無明顯沉淀，將裂解液全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)記好的1.5mL EP管中，室溫靜置5min；

E、往每個EP管中加0.2mL氯仿（Transzol Up體積的1/5），混勻振蕩30s，室溫靜置3min；

F、4℃條件下10000g離心15min，離心后RNA主要分布在上層水相中，體積約50%；

G、轉(zhuǎn)移上層水相于新的EP管中（約400μL，注意不要吸取到下層），每管加入0.5mL異丙醇 （Transzol Up體積的1/2），顛倒混勻，室溫孵育10min；

H、4℃下10000g離心10min后在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀，吸棄上清，加1mL 75%乙醇吹懸沉淀；

I、4℃下7500g離心5min后棄上清，盡量吸凈，室溫晾干沉淀5min，依細胞量加入30~100μL的RNA溶解液；

K、55℃~60℃金屬浴10min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2、cDNA合成：見上文

3、qPCR：按表2.6，在ABI熒光定量PCR儀專用96孔板中建立qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序為兩步法（表2.11）

4、RT-qPCR統(tǒng)計：每個基因在不同組別中的表達在獲得3個重復(fù)的Ct值后，從ABI系統(tǒng)中拷貝原始數(shù)據(jù)，挑出“Ct SD”值大于0.5的組別（需重新實驗），求出各個組的管家基因GAPDH的均值（一般相差1個Ct值以內(nèi)），再依次求出實驗組和對照組與各自的GAPDH之間的Ct差值，即得到第一個ΔCt，隨后求出實驗組ΔCt和對照組ΔCt的差值，即可得到第二個ΔCt（ΔΔCt），最后使用2 -ΔΔCt法求出實驗組相對于對照組的Ct值變化倍數(shù)（實驗組2 -ΔΔCt/對照組2 -ΔΔCt=實驗組2 -ΔΔCt/2 0=實驗組2 -ΔΔCt）。將3組實驗組數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad 9.0，輸入對照組數(shù)據(jù)為1，使用Student's t或ANOVA進行假設(shè)檢驗，p<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。